异丙酚对热损伤小鼠氧化应激损伤的保护效应探究

陈石生

（南方医科大学南方医院太和分院内科 广东广州510540）

中暑属于急性热致疾病，表现为中心体温迅速升高至40℃以上，伴有中暑神经功能障碍，严重时可引起多脏器功能障碍综合征（MODS），具有较高的致残率、病死率[1]。高热可造成人脐静脉内皮细胞（HUVECs）发生氧化应激反应，增加细胞内活性氧（ROS）生成，介导内皮细胞损伤，引起细胞毒性改变，诱发细胞凋亡[2~3]。异丙酚是一种短效、快速的镇静药，具有不良反应少、易唤醒、起效快等优点，同时可抑制细胞内ROS生成，减轻细胞损害[4]。但异丙酚是否能够有效改善热损伤所致的氧化应激损伤研究较少。本研究分析异丙酚对热损伤小鼠氧化应激损伤的保护效应，为临床治疗提供新思路。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器Gibco公司的胎牛血清（FBS）、胰酶、双抗；购自ThermoScientificTM公司的ROS、酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒；Caspase活性检测试剂盒（Biovision公司）；英国Astra Zeneca公司提供的异丙酚；流式细胞仪（美国BD公司）；脂肪乳购自辅仁药业集团有限公司；酶标仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 实验动物SPF级BALB/c小鼠，雄性，6~8周龄，体质量25~30 g，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2011-0015。1.3模型制作与分组 按随机数字表法将BALB/c小鼠分为37℃组、37℃+异丙酚组、37℃+脂肪乳组、43℃组、H2O2+异丙酚组、43℃+异丙酚组6组，每组10只。HUVECs铺入细胞培养皿内，密度1.0×105/ml，置入43℃细胞培养箱内实施2 h热打击，随后以5%CO2、37℃常规培养6 h，创建HUVECs热打击模型。37℃+脂肪乳组：在含10%脂肪乳培养基内置入细胞，时间为6 h；37℃+异丙酚组：在含50 μM异丙酚培养基内置入细胞，时间为6 h；43℃+异丙酚组：在含50 μM异丙酚培养基内置入细胞，时间为6 h，随后实施热打击；H2O2+异丙酚组：细胞先用200 μM H2O2预处理，再置入含50 μM异丙酚培养基内置入细胞，时间为6 h。

1.4 细胞活力检测 用WST-1法检测，各组处理后放置在孵育箱（37℃）内培养6 h，分别在96孔板的每孔内加入约10 μl WST-1，置于细胞培养箱内孵育2 h。用酶联免疫检测仪读取450 nm处的OD值，判断细胞活力。

1.5 ROS检测 用荧光探针法测定主动脉内皮ROS表达。按照试剂盒处理主动脉内皮组织，均浆，冷PBS重悬，加入适量荧光探针DHE，37℃、避光孵育30 min，细胞内ROS变化用流式细胞仪测定，激发、发射波长分别为353 nm、515 nm。

1.6 ATP含量检测 用荧光素-荧光素酶法，将对数生长期HUVECs铺入96孔板，每孔5×103，细胞贴壁稳定后进行上述分组处理，为获得背景数值，另准备对照孔，只含HPSS液，不含细胞。每孔内加入与细胞悬液等体积的荧光素酶试剂，室温避光，孵育10 min，稳定荧光，用多光谱微孔板阅读器分析荧光强度。

1.7 Caspase活性检测 取对数生长期、生长状态良好的HUVECs实施分组处理，收集细胞，PBS冲洗，重复3次，滴加50 μl细胞裂解液，4℃下作用10 min，对样品裂解，以12 000 r/min转速离心操作1 min，取上清液。分别在每个细胞样品内加入Caspase底物Ac-DEVD-AMC，37℃下孵育2 h，对Caspase-3/9活性检测。用酶标仪读取405 nm的OD值。

1.8 统计学方法 应用SPSS21.0软件分析数据，用（±s）表示计量资料，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力对比37℃各组细胞活力对比，无统计学差异（P＞0.05），43℃组细胞活力低于37℃组，且H2O2+异丙酚组、43℃+异丙酚组细胞活力高于43℃组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞活力对比

2.2 各组细胞内ROS情况对比37℃各组细胞内ROS含量对比，无统计学差异（P＞0.05）；43℃组细胞内ROS含量高于37℃组，H2O2+异丙酚组、43℃+异丙酚组细胞内ROS含量低于43℃组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞内ROS情况对比

2.3 各组细胞内ATP情况对比37℃各组细胞内ATP含量对比，无统计学差异（P＞0.05）；43℃组细胞内ROS含量低于37℃组，43℃+异丙酚组、H2O2+异丙酚组细胞内ATP含量高于43℃组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 各组细胞内ATP情况对比

2.4 各组细胞Caspase-3、Caspase-9活性情况对比37℃各组细胞内Caspase活性对比，无统计学差异（P＞0.05）；43℃组细胞 内Caspase-3/9活性高于37℃组，43℃+异丙酚组、H2O2+异丙酚组细胞内Caspase-3/9活性低于43℃组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞Caspase-3、Caspase-9活性情况对比

3 讨论

中暑的病理生理学反应除热暴露直接损伤外，继发于热损伤后全身炎症反应综合征更为关键，能进展为“类脓毒症”反应，诱发MODS过程[5]。在早期热损伤中血管内皮细胞（VECs）占有重要地位，既是热损伤效应器官，可覆盖于全身器官血管内皮和循环系统，又是热损伤的放大器官，其损伤能够引起凝血激活、炎症放大，损伤各种器官功能[6~7]。另外，VECs会减少内皮表面糖包和内皮细胞生成活化蛋白C等抗凝成分，增加vWF等促凝成分，促使血小板活化，促进微血栓形成，减少组织灌注，诱发脏器功能障碍，并会造成内皮损害加重，形成恶性循环，最终诱发MODS。

ROS是中暑过程中VECs损伤的重要方式之一，热损伤早期会损伤细胞DNA，增加细胞内ROS爆发性，损伤线粒体，造成细胞死亡。使用ROS特异性抑制剂能够使细胞内ROS水平，逆转热损伤所致的细胞损伤[8]。本研究结果提示在热损伤过程中，异丙酚可发挥抗凋亡、抗氧化损伤、保护线粒体作用。异丙酚起效迅速，用药后可迅速穿过细胞膜，广泛分布至全身各器官组织内，可使自由基对ATP的损伤减轻，抑制钙超载，有助于线粒体呼吸功能改善，还能影响线粒体脂质过氧化过程，防止线粒体内膜流动性改变、通透性增高，对线粒体膜结构形成保护[9~10]。异丙酚可使热损伤引起的内皮细胞氧化损伤减轻，增加内皮细胞线粒体膜电位、MPTP稳定性，提高细胞内ATP水平，对Caspase介导的线粒体凋亡通络形成抑制，阻碍其活化，进而改善内皮细胞线粒体功能。另外，异丙酚还能经抑制中性粒细胞呼吸爆发、调节细胞内钙离子平衡、减少自由基生成、抑制炎症介质与细胞因子表达等发挥抗氧化作用。

综上所述，在热损伤过程中，异丙酚可发挥抗凋亡、抗氧化损伤、保护线粒体作用。