龙血竭治疗溃疡性结肠炎小鼠的研究

何嘉宁，党昌发，马瑞旻，古欣怡，刘红波，吕蕊花，贺太平，史琳娜

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

0 引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性炎症性肠道疾病，临床表现为腹痛、腹泻及黏液血样便等，与结肠癌的发生密切相关[1]。西医治疗UC多使用5-氨基水杨酸盐、硫嘌呤、肿瘤坏死因子α抑制剂、整合素受体拮抗剂和小分子靶向抑制剂等药物，长期服用费用昂贵，易引发过敏反应、肝肾损害、肿瘤等并发症[2]。肠黏膜屏障受损失是UC发生发展中的关键环节，止血与促进溃疡愈合是UC治疗的关键[3]。龙血竭是中医治疗外伤出血、久不收口类疾病的传统中药之一，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等功效，临床常与其他药物联用治疗UC获得良好疗效[4]。本实验以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立小鼠急性UC模型，观察龙血竭对UC小鼠治疗效果，为促进其在临床中应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：Balb/c小鼠40只，体重20～22g、雌雄各半，由成都达硕实验动物有限公司提供。

试剂与仪器：葡聚糖硫酸钠(DSS)、羧甲基纤维素钠(CMC)、二甲苯、无水乙醇、苏木精-伊红染液购自博泰化玻仪器公司，IL-6和IL-10免疫组化试剂盒购自上海BIOTECH公司。Leica RM 2235切片机(德国徕卡公司)，ZEISS显微镜(德国蔡司公司)，Biotek800TS酶标仪(美国博腾公司)。

药物：龙血竭胶囊(云南云河药业股份有限公司)，柳氮磺胺吡啶肠溶片(上海信谊天平药业股份有限公司)。

2 实验方法

2.1 UC小鼠模型的建立、分组及给药

实验前小鼠适应性喂养1周，标准饲料喂养，自由饮用纯水。将40只小鼠随机分为空白组、模型组、西药组和中药组，每组10只，雌雄各半。空白组小鼠自由饮用纯水。模型组、西药组和中药组小鼠自由饮用3%DSS溶液7d。第8d开始，将药物按照成人使用量换算成小鼠用量，西药组给予0.45 mg/g柳氮磺胺吡啶肠溶片(5%羧甲基纤维素钠作为溶剂)灌胃，中药组给予0.54mg/g龙血竭胶囊(5%羧甲基纤维素钠作为溶剂)灌胃，空白组和模型组给予5%羧甲基纤维素钠溶剂灌胃，连续给药14d。每天定时称量小鼠体重，观察粪便性状并进行隐血测定。

2.2 疾病活动指数(DAI)评分

根据文献[5]，DAI= (体重下降分数+粪便性状分数+隐血分数)/3。评分标准如表1所示。

表1 疾病活动指数评分标准

2.3 小鼠血清炎症因子测定

给药14 d后，小鼠眼球取血，离心后分离血清，-80℃保存。ELISA试剂盒检测小鼠血清中炎症因子IL-6和IL-10含量。

2.4 小鼠结肠组织形态学观察

给药14d后，颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察小鼠结肠组织病理变化。

2.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 小鼠一般情况观察

结果如图1和图2所示，空白组小鼠生长情况良好，体重一直呈上升趋势，粪便正常、无血便，生存率为100%。模型组、西药组和中药组自由饮用DSS溶液后，第3d出现稀便，第5d有血便，体重呈下降趋势。模型组小鼠第7d后腹泻、血便、体重下降症状逐渐加重，第9d开始有小鼠死亡，停止饮用DSS后1w(第14d)，症状略有缓解，至21d生存率为50%。西药组和中药组小鼠灌药后体重逐渐上升，腹泻和血便情况逐渐改善，至21d生存率分别为90%和70%。

图1 小鼠体重变化

图2 小鼠生存曲线

3.2 小鼠DAI评分

空白组小鼠DAI一直为0分。其余组小鼠自由饮用DSS溶液期间，DAI分值逐渐上升。模型组停止饮用DSS后，症状不再加重，DAI评分维持在8分。西药组和中药组灌药治疗后DAI评分与模型组相比显著降低，且中药组DAI评分降低更显著(如图3所示)。

图3 各组小鼠DAI评分曲线

3.3 小鼠血清炎症因子检测结果

ELISA检测小鼠血清炎症因子结果如图4所示。模型组、中药组、西药组小鼠血清中IL-6水平均显著高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.001)，且模型组最高，其次为西药组。与空白组相比，中药组和西药组小鼠血清中IL-10水平显著增高，差异有统计学意义(P＜0.001)，且中药组增高最显著。

图4 小鼠血清IL-6和IL-10检测结果

3.4 小鼠结肠组织形态学观察结果

小鼠结肠组织HE染色结果如图5所示。空白组小鼠结肠组织无炎症细胞浸润，可见杯状细胞，隐窝结构正常。模型组小鼠结肠组织内炎性细胞浸润严重，大量杯状细胞消失，可见黏膜损伤、隐窝分支、扭曲及萎缩。西药组和中药组小鼠结肠黏膜损伤及炎症状态显著减轻，未见明显隐窝异常变化，中药组较西药组黏膜炎性细胞少见，部分标本出现杯状细胞重新长出现象。

图5 小鼠结肠组织HE染色结果(100×)

4 讨论

目前，UC尚无治愈的药物和方法，临床治疗主要以控制发作、改善症状、促进肠黏膜愈合和防止复发等。中医认为UC属“泄泻”“便血”“肠澼”“大瘕泄”范畴，湿热瘀毒内蕴为其主要病机，治宜清热燥湿，解毒化瘀，涩肠生肌[6]。龙血竭具有活血散瘀，定痛止血，敛疮生肌的功效，现代药理研究证实有抑制炎症、活血止血、保护心血管、抗纤维化和抑菌等作用[7]。本实验结果显示，与模型组相比，中药组小鼠死亡率显著降低，腹泻和便血症明显改善，提示龙血竭可改善UC小鼠的临床病理症状。结肠组织形态学观察显示，中药组小鼠结肠组织黏膜损伤和炎性细胞浸润显著减轻，提示龙血竭可促进结肠黏膜愈合、抑制炎症反应从而阻滞UC的发生和发展。柳氮磺胺吡啶是临床治疗溃疡性结肠炎常用的药物之一，具有抗菌消炎和免疫抑制作用[8]。本实验发现龙血竭在降低小鼠死亡率、缓解症状、抑制炎症方面效果优于柳氮磺胺吡啶，具有临床推广应用的价值。大量临床研究证实龙血竭与其他药物联用治疗UC效果显著，可显著改善结肠病变部位炎症和组织坏死，促进结肠黏膜愈合，但其作用机制尚不完全清楚[9]。崔晓娟等[3]基于网络药理学分析认为龙血竭作用机制是通过调控ABL1、F2、JAK2等靶点表达，间接调控IL-6、PTGS2等蛋白表达，进而干预JAK2/STAT3、PI3K-Akt-m TOR通路，调节炎症因子的水平，抑制炎症反应，最终缓解UC小鼠结肠黏膜损伤。未来将基于信号通路对龙血竭作用机制做进一步研究，以期为中药治疗UC提供更多的科学依据。