NFATc1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

李智慧，姚菲菲，王富霞

（郑州人民医院呼吸内科，郑州 450000）

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌类型的80%[1-2]。经过积极的手术切除、化学和放射治疗后，局部未转移患者的5年生存率约为55%，区域性疾病患者约为27%，远期转移患者约为4%[3]。这主要由于早期就诊率低且确诊时大多处于晚期阶段[4]。因此，寻找灵敏的肿瘤标志物和有效的治疗策略是亟待解决的问题。近年来，研究表明活化T细胞核因子（NFAT）参与肿瘤的发生、发展[5]。在前列腺癌中，活化T细胞c1核因子1（activated T cell c1 nuclear factor1，NFATc1）的表达水平增加，降低NFATc1的表达水平后，对膀胱癌细胞的增殖和转移有一定的抑制作用，可能是膀胱癌治疗的有效靶点之一[6]。在卵巢癌中，NFATc1可促进癌细胞增殖，发挥致癌作用[7]。而在NSCLC中，对NFATc1的表达水平及可能发挥的作用机制研究较少，本研究主要检测NFATc1在NSCLC细胞中的表达水平，利用转染技术敲低NFATc1的表达，进一步分析NFATc1对NSCLC细胞增殖、迁移和上皮间充质转化（EMT）的影响，为NSCLC的靶向治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料NSCLC细胞H1650、H460、H1299及正常人支气管上皮细胞BEAS-2B（上海细胞生物学研究所）；RPMI1640培养基（北京鼎国有限公司）；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；NFATc1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、β-actin一抗和二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；阴性对照质粒（si-NC）、NFATc1干扰质粒（si-NFATc1）和NFATc1 mimic质粒由北京华大基因合成。

1.2 实验方法

1.2.1 逆转录定量PCR（qRT-PCR）提取H1650、H460、H1299和BEAS-2B细胞中的总RNA，反转录为cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行实时定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作为内参照。引物设计如下：NFATc1上游引物序列5′-CACCGCATCACAGGGAAGAC-3′，下游引物序列5′-GCACAGTCAATGACGGCTC-3′，GAPDH上游引物序列5′-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGA C-3′，下游引物序列5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGT C-3′。反应条件：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，42个循环，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。

1.2.2 转染实验 取对数生长期的H1650细胞进行转染实验，以104个/孔的密度接种于6孔细胞板，常规培养24 h，分为si-NC组和si-NFATc1组，按照脂质体lipofeetamine 2000说明书步骤操作，转染6 h后，更换新鲜培养基，放置恒温箱中继续培养48 h，收集各组细胞利用qRT-PCR和Wenstern印迹检测转染效果，qRT-PCR具体实验操作见1.2.1，Wenstern印迹具体实验操作见1.2.3。

1.2.3 Western印迹实验 收集si-NC组、si-NFATc1组细胞加入适量蛋白裂解液，放置冰块上裂解30 min。收集上清，利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取30 μg蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白湿转至PVDF膜上。配置5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加anti-NFATc1（1∶1 000）在4℃冰箱中过夜孵育。采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。之后滴加二抗（1∶4 000）室温孵育1 h，采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。配置一定量的显影液，均匀滴加在膜上，曝光拍照。

1.2.4 CCK-8增殖实验CCK-8试剂检测细胞增殖情况，将si-NC组和si-NFATc1组细胞以每孔2×103的密度接种于96孔板中，每组细胞6个平行孔。饥饿过夜，然后更换含有10%胎牛血清的培养基。放置37℃、5%CO2条件的恒温箱中培养，分别在更换培养基的12、24、36、48、60、72 h时，至于酶标仪450 nm处检测细胞光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 集落形成实验 将si-NC组和si-NFATc1组细胞悬液，反复吹打使细胞分散，按照每皿200个细胞的密度接种至培养皿中，以十字方向轻轻混匀，放置操作台中静置10 min，移至恒温箱中培养，根据培养液pH值变化情况更换培养液，培养至肉眼可见的克隆形成，终止培养。弃去培养基，PBS溶液清洗1遍，加入3 mL甲醇固定15 min，然后用DAPI染料染色10 min，终止染色后PBS溶液清洗1遍，拍照并统计集落形成数量。

1.2.6 划痕实验si-NC组和si-NFATc1组细胞以30万每孔的密度接种至6孔板中，放置恒温箱中孵育24 h，用10 μL的枪头至上从下划一道伤痕，在显微镜下拍照。划痕宽度为a值。更换培养基，以免划掉的细胞再次脱落贴壁生长。继续培养24 h，放置显微镜下拍照，划痕宽度为b值。细胞迁移率=（a-b）/a×100%。

1.2.7 Western印迹实验 收集si-NC组、si-NFATc1组细胞加入适量蛋白裂解液，放置冰块上裂解30 min。收集上清，利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取30 μg蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白湿转至PVDF膜上。配置5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加anti-Vimentin、anti-N-cadherin、anti-E-cadherin抗体（1∶1 000），后续操作见1.2.3。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NFATc1在3种NSCLC细胞中高表达H1650、H460、H1299细胞中NFATc1 mRNA的相对表达水平均高于BEAS-2B细胞（t=10.732，P<0.001；t=4.705，P=0.009；t=4.792，P=0.009），且H1650细胞中NFATc1 mRNA表达水平高于H460、H1299细胞（t=3.593，P=0.023；t=7.505，P=0.002），见图1。

图1 不同细胞系中NFATc1 mRNA的相对表达水平Fig 1 Relative expression of NFATc1 mRNA in different cell lines

2.2 验证si-NFATc1对H1650的敲低效率 将si-NC、si-NFATc1转染至H1650细胞后，在mRNA和蛋白质水平分别检测敲低效率，结果显示转染si-NFATc1组NFATc1 mRNA低于si-NC组（t=9.325，P<0.001），NFATc1蛋白灰度值低于si-NC组（t=10.254，P<0.001），见图2。

图2 特异性si-NFATc1对H1650的敲低效率Fig 2 Knockdown efficiency of specific si-NFATc1 on H1650

2.3 敲低NFATc1后可有效抑制H1650细胞的增殖 采用CCK8和集落形成实验检测转染质粒后细胞的增殖能力，培养72 h si-NFATc1组细胞的OD值低于si-NC组（t=7.954，P<0.001），细胞集落形成数低于si-NC组（t=12.210，P<0.001），见图3。

图3 敲低NFATc1后对H1650细胞增殖的影响Fig 3 The effect of knocking down NFATc1 on the proliferation of H1650 cells

2.4 敲低NFATc1后可有效抑制H1650细胞的迁移 利用迁移实验检测转染后细胞的迁移率，结果显示si-NFATc1组细胞的迁移率低于si-NC组（t=8.951，P<0.001），见图4。

图4 敲低NFATc1后对H1650细胞迁移的影响Fig 4 The effect of knocking down NFATc1 on the migration of H1650 cell

2.5 敲低NFATc1后可减弱H1650细胞的EMT能力 选择Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白水平评估EMT能力，Western印迹实验显示si-NFATc1组E-cadherin蛋白水平高于si-NC组（t=6.352，P<0.001），Vimentin和N-cadherin蛋白的表达水平低于si-NC组（t=6.012，P<0.001；t=10.241，P<0.001），见图5。

图5 敲低NFATc1后对H1650细胞EMT的影响Fig 5 The effect of knocking down NFATc1 on EMT of H1650 cells

3 讨论

NSCLC是最常见的肺癌，尽管其诊治水平在不断提高，但死亡率仍居高不下。因此，最重要的是研究肺癌发生、发展的潜在机制，并确定其诊断和治疗的基因靶标。NFAT蛋白属于炎症转录因子家族，主要在T细胞活化的背景下参与炎症反应。NFAT活性不仅限于免疫系统，还与几种恶性肿瘤的发生、发展有关。最近有多项研究显示，NFATc1具有致癌性，NFATc1在前列腺癌的治疗中具有一定的临床价值，与卵巢癌的不良预后相关，可促进胶质母细胞瘤侵袭[8-10]。但NFATc1在NSCLC中的作用机制目前研究还较少见，在本研究中发现NFATc1 mRNA水平在3种NSCLC细胞系中的表达水平均上调，并对EMT有影响。EMT是细胞失去上皮特征并获得间质特征的过程，通常由上皮标志物E-cadherin的丢失和间充质标志物Vimentin的表达增加来定义。上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力[11]。EMT与多种肿瘤功能有关，包括肿瘤发生、恶性进展、肿瘤细胞迁移和对治疗的抵抗性[12]。本研究中，敲低NFATc1表达水平后，增强了上皮标志物E-cadherin的表达，减弱N-cadherin和Vimentin的表达，表明NFATc1表达降低后可减弱NSCLC细胞EMT作用，以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

NFATc1在NSCLC细胞系中的表达水平增加，推断其在NSCLC中发挥促癌基因作用。LI等[13]研究显示，在卵巢癌中NFATc1的表达水平增加，降低其表达水平后可显著降低卵巢癌细胞在裸鼠中的增殖、迁移和侵袭能力，并减少卵巢癌的肿瘤发生。此外，在膀胱癌中亦观察到NFATc1的高表达，NFATc1与根治性前列腺切除术后的复发风险之间存在相关性，表明NFATc1在膀胱癌发展过程中至关重要[14]。本研究中敲低NFATc1的表达后可明显抑制NSCLC细胞的增殖和迁移，与以上的研究结果相一致。HE等[15]研究显示，叉头框蛋白C2可增强NSCLC细胞的增殖和EMT，有可能成为治疗NSCLC的有效靶点。WANG等[16]研究显示，Wnt5a可促进NSCLC细胞EMT和细胞的转移，有望成为治疗NSCLC的有效靶点。FBXW7可抑制NSCLC细胞EMT和顺铂耐药，增加FBXW7的表达水平有可能成为治疗NSCLC的方法之一[17]。本研究中NFATc1在NSCLC中的表达水平增加，降低其表达水平后可显著抑制细胞的增殖、迁移和EMT。

综上所述，NFATc1在NSCLC中表达水平增加，发挥促癌基因的作用，降低NFATc1的表达水平后可抑制NSCLC细胞增殖和EMT。因此，NFATc1有望成为NSCLC治疗的有效靶点。