miR-133过表达对结肠癌细胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影响

潘琼，谷见法，刘松格，杨晓瑞，易善永

（郑州市中心医院肿瘤内科，郑州 450000）

结肠癌是一种常见的胃肠道肿瘤，在世界范围内的发病率和与癌症相关的死亡率中位居前例[1]。相关研究表明，癌基因的激活和抑癌基因的失活对结肠癌的发生、发展起重要作用[2]。尽管在诊断和治疗上有很大进步，但其发病机制尚未完全明了。因此，需要进一步探寻结肠癌的关键分子机制，为结肠癌患者开发更有效的疗法。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为19～24 nt的内源性非编码小RNA，通过靶向靶基因3′-UTR的碱基互补配对结合，引起转录抑制或调节mRNA降解，从而在植物和动物中发挥重要作用[3]。miRNA控制并参与多种细胞过程的基因表达，包括炎症、代谢、增殖和细胞凋亡[4]。已有研究表明miR-133在肺癌、胃癌、膀胱癌和前列腺癌中表达下调，miR-133过表达抑制癌细胞的恶性行为，提示其可能是阻断癌症进展的靶点[5-8]。但目前miR-133在结肠癌进程中的作用和潜在机制尚不完全清楚，相关研究很少，本文旨在探究miR-133过表达对结肠癌细胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂RPMI1640培养基（61870-127）、胎牛血清（26400-036）、青-链霉素（15140-122）和胰蛋白酶（25200-056）均购自美国Gibco公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（A0208）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C1062S）、CCK-8试剂盒（C0037）购自上海碧云天生物技术研究所；兔抗Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Caspase-9（ab52298）、cleaved Caspase-9（ab2324）、c-Myc（ab39688）、GAPDH（ab9485）单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养 人结肠癌SW480细胞株来源于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），置于37℃，5%CO2恒温培养箱中用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清和1%青-链霉素）培养，每3 d传代1次，收集细胞时用0.25%胰蛋白酶消化，实验选用对数生长期细胞。

1.3 细胞处理及分组 将SW480细胞接种于6孔板（1×105个/孔），待60%融合度时更换为无血清培养基。采用LipoRNAiTM转染试剂将Scramble和miR-133 mimic转染至SW480细胞，细胞分组为：对照组、Scramble组和miR-133 mimic组。

1.4 RT-PCR检测miR-133表达 用Trizol法从各组SW480细胞中提取总RNA，采用PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，通过SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，miR-133上游引物：5′-TTTGGTCCCCTTCAACC-3′，下游引物：5′-GAGCAGGGTCCGAGGT-3′。反应条件为：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，45个循环，72℃10 min。miR-133的相对表达使用公式2-ΔΔCt计算。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 胰蛋白酶消化并收集SW480细胞到10 mL的离心管中，每样本细胞数为3×106/mL，1 500 r/min离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，重悬细胞后室温避光孵育15 min，加入10 μL Annexin V-FITC后避光孵育10 min，加入10 μL碘化丙啶避光孵育30 min后，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.6 Western印迹检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表达水平 取各组对数生长期SW480细胞裂解提取总蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白质含量。取等量蛋白质样品100℃变性5 min后用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至聚偏氟乙烯膜，在4℃条件下加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和c-Myc一抗（1∶1 000）并孵育过夜，PBST清洗3次，4℃下加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶5 000），孵育1 h，最后加入ECL发光液曝光拍照。以GAPDH为内参，目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表达水平。

1.7 CCK-8检测细胞增殖倍数 收集各组SW480细胞，接种至96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃下培养4 d，于第24、48、72、96小时检测450 nm处吸光度值计算细胞增殖倍数。

1.8 克隆形成实验检测细胞克隆形成率 在培养皿中培养SW480细胞4 d，接种至6孔板，每孔约500个细胞，培养14 d，用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%结晶紫染色，PBS清洗后拍照观察细胞克隆形成数目，计算细胞克隆形成率。细胞克隆形成率=细胞克隆数/接种细胞数×100%。

1.9 结肠癌裸鼠移植瘤模型10只30日龄雄性Balb/c裸鼠购自北京维通利华动物科技有限公司，体重（20±2）g，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0009，在特定的无病原体条件下饲养。取方法1.3对照组和miR-133 mimic组细胞用PBS将细胞密度调至1×107/mL，于裸鼠右侧腋窝处皮下注射0.2 mL细胞悬液，将裸鼠随机分为2组：对照组和miR-133 mimic组。第28天处死所有裸鼠，检测裸鼠肿瘤重量，RT-PCR检测裸鼠肿瘤miR-133表达水平。

1.10 免疫组化检测Caspase-3、Ki67阳性细胞数 取各组裸鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋切片，厚度约为4 μm，按免疫组化检测试剂盒说明书对各组裸鼠肿瘤组织进行免疫组化染色，DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，光学显微镜观察Caspase-3、Ki67在肿瘤组织中的表达情况。

1.11 统计学处理 使用GraphPad Prism 5进行统计分析，正态分布的计量资料表示为±s，组间比较采取SNK-t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480细胞转染miR-133 mimic通过RTPCR检测miR-133表达水平，结果如图1所示，与对照组相比，miR-133 mimic组miR-133表达显著升高（F=136.70，P＜0.05）。

图1 SW480细胞转染miR-133 mimicFig 1 SW480 cells transfected with miR-133 mimic

2.2 miR-133过表达对SW480细胞凋亡的影响 通过流式细胞仪检测各组SW480细胞凋亡率，结果如图2所示，与对照组相比，miR-133 mimic组细胞凋亡率显著升高（F=59.995，P＜0.05）。

2.3 miR-133过表达对SW480细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表达水平的影响 通过Western印迹检测各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表达水平，结果如图3所示，与对照组相比，miR-133 mimic组Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9表达显著升高（F=726.85、138.76、55.85，均P＜0.05），c-Myc蛋白表达水平显著降低（F=88.98，P＜0.05）。

注：与对照组比较，*P＜0.05

图3 miR-133过表达对SW480细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表达水平的影响Fig 3 Effects of miR-133 overexpression on the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspase-9 and c-Myc in SW480 cells

2.4 miR-133过表达对SW480细胞活力的影响 通过CCK-8法检测各组细胞活力，结果如图4所示，与对照组相比，miR-133 mimic组细胞活力显著降低（F=48.50，P＜0.05）。

注：与对照组比较，*P＜0.05

2.5 miR-133过表达对SW480细胞增殖的影响 通过克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率如图5所示，与对照组相比，miR-133 mimic组细胞克隆形成率显著降低（F=42.63，P＜0.05）。

图5 miR-133过表达对SW480细胞克隆形成率的影响（200×）Fig 5 Effect of miR-133 overexpression on the clonal formation rate of SW480 cells（200×）

2.6 miR-133过表达对结肠癌裸鼠移植瘤成瘤的影响 检测各组裸鼠肿瘤重量如图6A、B所示，与对照组相比，miR-133 mimic组肿瘤重量显著降低（t=1.788，P＜0.05）；RT-PCR检 测 各 组 裸 鼠 肿 瘤miR-133表达水平结果如图6C所示，与对照组相比，miR-133mimic组miR-133表达水平显著升高（t=1.043，P＜0.05）；免疫组化检测各组裸鼠Caspase-3、Ki67阳性细胞数结果如图6D所示，与对照组相比，miR-133 mimic组Caspase-3阳性细胞数显著升高（t=1.167，P＜0.05），Ki67阳性细胞数显著降低（t=1.557，P＜0.05）。

图6 miR-133过表达对结肠癌裸鼠移植瘤成瘤的影响（200×）Fig 6 Effect of miR-133 overexpression on tumorigenesis in nude mice with colon cancer（200×）

3 讨论

结肠癌是一种常发于中老年群体的恶性消化道肿瘤，主要发病部位为直肠与乙状结肠交界处。结肠癌早期症状不典型，诊断困难，且多数患者发现时已处于癌症中晚期，导致预后较差。因而，迫切需要探寻早期诊断结肠癌的生物学标志物。

细胞凋亡途径的活化是治疗肿瘤最主要的方法之一。细胞凋亡分为外源性、内源性及内质网应激凋亡途径[9]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是细胞凋亡的关键调控因子，升高Bax/Bcl-2比值可诱导细胞凋亡，降低Bax/Bcl-2比值则抑制细胞凋亡[10]。细胞质中的Caspase-3一般无活性，并以ProCaspase-3形式存在，当细胞受到凋亡刺激时，被激活进而诱导细胞发生凋亡，当Caspase-3活化时意味着凋亡进入不可逆阶段[11]。Caspase-9是一种常见凋亡启动因子，可通过激活下游凋亡执行因子启动凋亡[12]。C-myc是一种常见的原癌基因，可促进细胞增殖或诱导细胞凋亡，在结肠癌组织中异常高表达[13]。ZHANG等[14]研究发现，miR-133靶向YES原癌基因1，诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡。许荣华等[15]研究发现，上调miR-133水平可抑制胃癌细胞的侵袭并诱导凋亡。本研究发现，miR-133过表达具有升高SW480细胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9表达，降低c-Myc蛋白表达水平和升高结肠癌裸鼠移植瘤Caspase-3阳性表达率的作用。提示miR-133过表达通过调节线粒体凋亡通路凋亡因子，诱导SW480细胞凋亡，促进结肠癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡。

结肠癌的发生、发展是多步骤、多基因变化的过程，从分子角度出发，抑制癌细胞增殖是治疗结肠癌的基本策略[16]。Ki67在肿瘤组织中的表达强度与肿瘤细胞的增殖密切相关。已有研究表明，Ki67在结肠癌肿瘤组织中高表达[17]。彭玉平等[18]研究发现，miR-13通过靶向JAK2抑制胃癌细胞增殖。胡东辉等[19]研究发现，miR-133通过影响EGFR表达而抑制肝癌细胞的增殖。本研究发现，miR-133过表达可降低SW480细胞克隆形成率和结肠癌裸鼠移植瘤Ki67的阳性表达率。提示miR-133过表达抑制SW480细胞和结肠癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞增殖。

综上所述，本研究通过过表达SW480中miR-133，观察其对SW480细胞生物学的影响。结果证实，miR-133过表达诱导SW480细胞凋亡，抑制SW480细胞增殖和裸鼠肿瘤的形成。miR-133可能为结肠癌的诊疗提供新的依据和分子靶点。