国产第4代人类免疫缺陷病毒化学发光试剂在血液筛查中的应用

陈明军，张燕，金新莉，吕永磊，方建华

(河南省红十字血液中心，河南 郑州 450012)

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是一种引起获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的逆转录病毒，通过抑制特异性抗体形成和维持有效的杀伤性T细胞活性进行性破坏免疫系统，严重危害患者身体健康[1]。截至2018年9月30日，中国报告现存活HIV感染者/AIDS患者849 602例，报告死亡262 442例[2]。血液传播是HIV最主要的传播途径之一，目前HIV检测主要标志物有抗原、抗体和RNA。由于RNA在血浆中出现最早，且能无限扩增，所以核酸检测技术能缩短检测“窗口期”，提高检测灵敏度。但HIV基因型复杂多样[3]，且相比抗原抗体，RNA稳定性较差，对检测环境要求较高。因此，抗原抗体检测在血液筛查中具有不可替代的作用。常用的抗原抗体检测方法有酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和化学发光免疫分析试验(chemiluminescence analysis，CLIA)2种，由于CLIA仪器试剂比较昂贵等原因，目前在医院应用较多，而血站多采用ELISA方法。CLIA和ELISA都有第3代和第4代 2种试剂，第4代是抗原抗体联合检测试剂，在第3代基础上增加了P24抗原检测功能[4]，在一定程度上弥补了抗体血清转换期较长的缺点。为了客观地了解和评估CLIA在血液筛查上的应用价值，国家卫生健康委临床检验中心牵头组织开展了化学发光多中心评估项目。本文通过分析河南省红十字血液中心实验室的检测结果，探讨国产第4代CLIA试剂的检测性能。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源国家卫生健康委临床检验中心提供的4套血清盘(编号A、B、C、D)，共330份样本，其中各血站HIV阳性献血者标本149份，阴性献血者标本78份，结果不确定样本5份[免疫印迹(Western blot，WB)出现任何特异性条带，但不足以判断为阳性]，特殊样本98份(阴性质控品13份，2种阳性质控品共63份，稀释样本10份，病毒培养液标本12份)。每套血清盘均设有阴性质控(n)和2种不同水平的阳性质控(C1，C2)。临床检验中心使用8种ELISA试剂和7种CLIA试剂对血清盘标本进行确认，如均为阴性则确认结果为阴性，反之判为阳性；结果不一致时核酸检测(nucleic acid testing，NAT)阳性则确认结果为阳性；如核酸结果为阴性，再根据WB判断，根据显示的条带最终分为阳性、阴性和不确定3种。

1.2 仪器与试剂仪器：STAR全自动加样器(瑞士HAMILTON公司)、FAME全自动酶免分析仪(瑞士HAMILTON公司)、KUBOTA8420台式离心机(日本久保田)、340RT HT3恒温酶标仪(奥地利Anthos公司)、AutoLumo A2000全自动化学发光测定仪(郑州安图)。试剂：第3代HIV酶免试剂(北京万泰，批号I20170614、I20170617)、第4代HIV酶免试剂(法国伯乐，批号7G0400、7H0405)、第3代HIV抗体化学发光试剂(郑州安图，批号20170923)、第4代HIV抗原抗体联合检测化学发光试剂(郑州安图，批号20171023)。以上试剂均在有效期内使用。

1.3 检测方法分别采用2种酶免试剂和2种化学发光试剂严格按照试剂说明书要求对330份血清盘标本进行HIV检测。当S/CO≥1时则判为该试剂检测结果为阳性，<1为阴性。梯度稀释标本检测结果≥1表示检测出，否则为未检测出。

1.4 统计学方法运用Excel 2010计算批内和批间精密度。采用SPSS 20.0统计软件处理数据。不同试剂检测结果的比较采用McNemar检验，P<0.05为差异有统计学意义。一致性检验采用Kappa系数检验，K≥0.75表示有较高的一致性，K>0.8表示有极好的一致性。去掉7份不确定样本和96份特殊样本，根据227份血清盘样本检测结果计算以下评价指标：灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数。

2 结果

2.1 批内精密度4种试剂2个水平质控品的批内变异系数(coefficient of variation，CV)都控制在10%以内。ELISA试剂的批内CV小于CLIA。见表1～2。

表1 A、C血清盘C1浓度批内精密度

表2 B、C血清盘C2水平批内精密度

2.2 批间精密度4种试剂2个水平质控品的批间CV都小于15%。CLIA试剂的批间CV小于ELISA。见表3。

表3 4种试剂2个不同水平质控的批间精密度

2.3 一致性分析2种第4代试剂的阳性符合率最高，阴性符合率最低。见表4。

表4 第4代CLIA试剂与其他3种试剂的一致性分析

2.4 4代试剂假阳性标本分析2种第4代试剂共检测出8份与确认结果不相符的标本，其中有6份(HIV D 52，HIV D 54，HIV D 55，HIV D 63，HIV B 64，HIV A 67)均为第4代ELISA试剂假阳性。见表5。

表5 2种第4代试剂与确认结果不符标本分析

2.5 稀释灵敏度4种试剂中除了第3代CLIA试剂，其他均能检测出2个1∶800的稀释标本。见表6。

表6 梯度稀释标本各试剂的检测结果

2.6 性能评价指标4种试剂中2种第4代试剂的灵敏度最高，第4代CLIA和第3代ELISA的特异度最好。见表7。

表7 4种试剂血清盘检测效果的评价指标/%

3 讨论

随着分子生物学技术的迅猛发展，HIV检测技术也在不断改进和更新。CLIA是继酶联免疫分析、放射免疫分析和荧光免疫分析之后发展起来的一种新兴标记免疫测定技术。CLIA包括磁微粒化学发光法和电化学发光法2种，本文探讨的是前者，它充分利用了磁性分离技术的快速、易自动化以及化学发光技术的高灵敏度和免疫分析技术的高特异度等优势，是检测微量抗原抗体比较理想的方法。

按照国家卫生健康委临床检验中心的统一部署和要求，本研究采用ELISA和CLIA 2种方法、4种试剂分别对330份无偿献血者标本进行检测。通过精密度评价，发现4种试剂均具有良好的重复性，批内CV都小于10%，与相关报道[5-6]相近。总体上，ELISA试剂的批内精密度要好于CLIA试剂，这可能是由于ELISA采用的是板式加样，对各微孔的处理几乎完全一样，所以得到的结果也十分接近，而CLIA采用自由上样，标本间的处理存在一定时间和空间差。相反，ELISA试剂的批间精密度不如CLIA试剂，这是由于CLIA自动一体化程度较高，且全封闭，步骤少，时间短，受外界因素干扰较少。另外，第4代CLIA的批内和批间CV均小于第3代，表明第4代试剂重复性和稳定性更佳。

ELISA试剂是国内所有血站都在使用的一种血液筛查试剂，试剂盒及实验技术都已十分成熟[7-8]。为了评价第4代CLIA试剂是否具有相似的检测能力，本研究对第4代CLIA试剂与其他3种试剂分别进行了符合性分析。从结果看，2种第4代试剂的阳性符合率最高，阴性符合率较低；Kappa系数检验表明4代CLIA试剂与其他试剂均具有极佳的一致性；McNemar检验结果也显示第4代CLIA试剂与其他3种试剂的检测结果比较，差异无统计学意义。本文检测的227份普通血清盘标本均来自于无偿献血者，所以通过以上结果，可认为第4代CLIA可以作为ELISA的替代试剂用于献血者的HIV筛查。本试验中，共有8份4代试剂与确认结果不符的标本，其中有6份均为第4代ELISA试剂假阳性，这也是导致表4中2种第4代试剂阴性符合率最低的主要原因。HIV D 19号标本NAT检测结果为阳性，所以该标本中可能存在很低水平的P24抗原而被第4代CLIA试剂检出，可以推测第4代CLIA试剂在微量抗原检测能力上优于第4代ELISA试剂。HIV D 44标本2种CLIA试剂均为假阳性，这可能是由于这2种试剂均来自同一厂家，而标本中恰有能与该厂家试剂发生交叉反应的干扰物质存在。梯度稀释标本检测结果显示除了第3代CLIA试剂外其他3种试剂均能检测出2个1∶800的抗体稀释标本，表明这3种试剂稀释灵敏度较好，而第3代CLIA试剂对低水平标本的检测能力还有待进一步提高。

为了更加直观地展示各试剂的检测性能，选择性计算了几个常见的评价指标。从结果看，第4代CLIA试剂的各项指标均是所有试剂中最优秀的，与其他文献[9-11]结论一致。其中，2种第4代试剂灵敏度均达到100%，表明阳性标本无一漏检。另据报道，第4代ELISA试剂存在较高的假阳性率，在低感染率人群中尤为明显[12-13]。本研究中也出现了6份第4代ELISA假阳性，远高于其他试剂，所以虽然灵敏度相同，但其特异度、准确度及Youden指数等指标不如第4代CLIA试剂。这也意味着如果第4代CLIA试剂用于无偿献血者标本筛检不仅可以保证较高的检出率，而且还能减少不必要的血液报废，防止合格的血标本流失。

另外，在试验过程中也发现了CLIA检测系统一些操作上的优点。首先该检测系统可以自由随机上样，检测项目能灵活组合试验时间等，因此对有疑问的标本可以立即复检，40 min就可出结果，这对血小板等一些保质期很短的血制品和急救用血来说具有十分重要的意义。CLIA试剂采用弹性膜密封，可以有效防止蒸发，并且化学发光仪具有冷藏功能，剩余的试剂无需取出可直接存放于仪器上。同时每种试剂均有条形码，可直接扫码使用，避免了ELISA试验中倒错试剂、贴错条码等常见的人为失误。最后，该检测系统全自动一体化程度高于目前ELISA试验常用的STAR-FAME系统，可以真正地实现无人值守模式，更加适合工作量较大的实验室使用。

总之，本研究表明CLIA比目前常用的ELISA血液筛查试剂检测性能更优，且具有较好的可操作性，值得在血液筛查中推广使用。