基于网络药理学的藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症作用机制研究

王松，周霖，王肖辉，金建文，武婧，贾雪冬，杨彦涛，杜书章，付智慧

(1.郑州大学第一附属医院 a.药学部;b.超声科;c.中医药学部，河南 郑州 450052；2.陕西丽彩药业有限公司，陕西 咸阳 712000)

骨质疏松症是一种以骨量减低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1-2]。随着机体的不断衰老，骨质疏松症状如骨折、骨痛、驼背、腰背痛等将会不同程度地出现。在我国，年龄大于60岁的老年人骨质疏松症患病率为36%，其中男性为23%，女性为49%[3]。骨质疏松症已成为影响中老年人身心健康、生活质量及生命安全的常见多发病。

中医学无“骨质疏松症”的病名，根据临床症状及体征可将其归为“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴，其病因病机可概括为肾精不足、脾胃虚弱、肝失条达和瘀血阻络[4]。藤黄健骨胶囊由莱菔子、骨碎补、肉苁蓉、鸡血藤、熟地黄、鹿衔草、淫羊藿组成，具有活血、补肾、止痛的功效，临床上可用来治疗骨质疏松症等[5-7]，能起到标本兼治的作用。藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松疗效显著，临床应用广泛，但目前其治疗疾病的有效活性成分、关键作用靶点及主要作用机制研究尚不清楚。基于此，本研究采用网络药理学方法[8]，通过检索数据库及相关网络分析，筛选出藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的活性成分及作用靶点，并构建“药物-活性成分-靶点”和“活性成分-重要靶点-关键通路”网络，系统探究药物、活性成分、靶点、通路的内在关联机制，明确藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的主要药效成分、重要靶点和关键通路，为藤黄健骨胶囊的临床应用、质量标准提升以及进一步的药理验证作用研究提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件研究使用到以下数据库及软件：Uniport(https://www.uniprot.org/)，TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)，DrugBank(https://www.drugbank.ca/)，DisGeNET(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)，OMIM(http://www.omim.org)，Genecards(https://www.genecards.org)，Omicshare云平台(https://www.omicshare.com/)，STRING(https://string-db.org/)，DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，Cytoscape 3.7.2软件。

1.2 藤黄健骨胶囊活性成分的筛选通过TCMSP数据库检索藤黄健骨胶囊各药物的化学成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[9-10]为限定条件对成分进行初步筛选，并通过查找相关文献补充TCMSP数据库未收录的成分，得到药物的主要活性成分及作用靶点。

1.3 藤黄健骨胶囊活性成分作用靶点获取通过TCMSP数据库得到以上活性成分对应的靶标蛋白，将靶标蛋白通过UniProt数据库、DrugBank数据库检索查询其对应的基因名称。

1.4 藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的靶点筛选在DisGeNET数据库、DrugBank数据库、OMIM数据库、Genecards数据库输入“osteoporosis”，检索、汇总、去重后获得骨质疏松症的靶点。使用OmicShare云平台中的维恩图软件，将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在作用靶点。

1.5 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建将中药材、活性成分及1.4项下所得的骨质疏松症潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，分析网络拓扑性质，采用network analyzer插件进行数据处理。

1.6 蛋白相互作用网络构建将1.4项中潜在靶点导入STRING数据库，勾选multiple proteins，物种选择homo sapines，构建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)关系图。

1.7 GO富集分析和KEGG通路分析为进一步研究藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在靶点基因功能及作用，将所得靶点导入DAVID数据库，设置P<0.05，物种为Homo Sapiens，并将靶基因名称校准为官方通用名称(official gene symbol)，进行GO和KEGG分析，最后按照其富集的靶点数目依次进行排序，选取排名靠前的10个条目绘制条形图。GO富集分析选取生物过程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)分别进行分析。

2 结果

2.1 藤黄健骨胶囊的活性成分通过TCMSP数据库，检索到骨碎补化学成分71个、鸡血藤68个、莱菔子52个、鹿衔草36个、肉苁蓉75个、熟地黄76个、淫羊藿130个。通过设定OB≥30%和DL≥0.18，筛选出符合条件的化合物，包括骨碎补有效成分18个、鸡血藤24个、莱菔子3个、鹿衔草9个、肉苁蓉6个、熟地黄2个、淫羊藿23个，删除重复共有成分后共计69个活性成分。见表1。

表1 藤黄健骨胶囊活性成分信息

表1(续)

2.2 藤黄健骨胶囊活性成分作用靶点通过UniProt数据库、DrugBank数据库，检索到骨碎补活性成分的潜在靶点282个，鸡血藤395个、莱菔子4个、鹿衔草274个、肉苁蓉212个、熟地黄31个、淫羊藿490个，去除重复靶点，共计257个。

2.3 藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在靶点通过OMIM数据库、Genecards数据库输入“osteoporosis”，检索、筛查并整合后共得到骨质疏松症作用靶点4 547个。使用OmicShare云平台中的维恩图软件，将藤黄健骨胶囊预测的靶点与骨质疏松症的靶点进行映射，获得藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的潜在作用靶点178个。见图1。

图1 藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症潜在靶点维恩图

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络模型及分析采用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点”网络模型(见图2)。该网络共有234个节点(包括178个靶点节点、56个活性化合物节点)，共有1 243条边(每条边代表活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系)。藤黄健骨胶囊中各药物之间存在各种相互作用关系，同一成分对应不同的靶点，不同成分也可对应同一靶点，形成复杂的作用网络，充分体现了藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松的多成分、多靶点治疗机制。基于Cytoscape 3.7.2软件中的“Network analyze”功能对作用网络进行拓扑属性分析，发现大于平均度值(度值表示连接到1个节点的线条数，线条越多表示关联度越大，故可以评估网络中每个节点的重要性)10.6的活性成分物有24个，其中大部分成分为黄酮类(66.7%)，含有效成分最多的药材为鸡血藤(12个)，其次为淫羊藿(9个)、骨碎补(8个)、肉苁蓉(4个)、鹿衔草(4个)、熟地黄(1个)。度值大于平均度值10.6的靶点有29个，分别是PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NCOA2、PPARG、AR、PIK3CG、ADRB2、DPP4、ESR1、RXRA、NOS2、GABRA1、CASP3、F10、CDK2、JUN、ESR2、GSK3B、MAPK14、NOS3、PDE3A、CCNA2、ACHE、BCL2、F2R、RELA、BAX、F7。以上化合物及靶点很可能是藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的核心化合物及靶点。

图2 “药物-活性成分-靶点”网络

2.5 PPI网络将藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的178个作用靶点导入STRING数据库，保存为TSV格式文件。将文件中的node1、node2、combined score信息导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制PPI网络，并进行Network analyze分析。如图3所示，网络中共包含177个节点(节点代表靶点)，3 446条边，网络中节点平均度值是38.9。图中节点越大、颜色越深，则表明度值越大，大于平均度值的靶点有69个(居于图3中间圆形的节点)，分别为AKT1、IL6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、JUN、EGF、CASP3、MAPK1、MAPK8、EGFR、STAT3、FOS、MMP9、PTGS2、MYC、ESR1、CCND1、IL1B、CAT、CCL2、MMP2、NOS3、IL10、PPARG、PTEN、MAPK14、HSP90AA1、AR、ERBB2、ICAM1、SERPINE1、HMOX1、IL2、BCL2L1、RELA、IL4、CASP8、STAT1、VCAM1、HIF1A、CAV1、SPP1、MPO、IFNG、CRP、NR3C1、TGFB1、ADIPOQ、KDR、AHR、CASP9、MMP1、MCL1、NOS2、CXCL10、MMP3、NFKBIA、NFE2L2、SOD1、CDK4、PLAU、SELE、CCNB1、PARP1、IGF2、SREBF1、CD40LG。

图3 藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的蛋白 相互作用(PPI)网络

2.6 GO功能富集和KEGG通路分析将以上靶点导入DAVID数据库，共得到GO富集条目713个，其中BP 543个，MF 111个，CC 59个。BP方面与骨质疏松症相关的生物过程有18条，选取BP与骨质疏松症相关的10个条目、MF与CC排名前10位的条目，分别绘制条形图(图4)。BP主要富集在对雌二醇的反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正向调控、凋亡过程、ERK1和ERK2级联的正调控、血管收缩的正调控、炎症反应、NF-kappaB转录因子活性的正调控、MAPK级联调控以及Wnt信号途径等。MF主要富集在酶结合、蛋白结合、蛋白质均二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等。CC方面，在细胞外基质、胞质溶胶、膜筏、小窝、质膜、细胞外区域、核质、线粒体、核染色质、质膜的组成部分占比较大。KEGG通路分析结果显示，共得到信号通路117条，其中，与骨质疏松症密切相关的通路有16条，这些通路多数与炎症高度相关，见图5。

图4 GO分析生物过程、分子功能、细胞组分情况

图5 KEGG通路富集分析

2.7 “活性成分-重要靶点-关键通路”网络模型及分析基于以上结果信息，整理出药物的活性成分、重要靶点和关键通路，导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“活性成分-重要靶点-关键通路”网络模型，并进行Network analyze分析。该网络共有158个节点，987条边，平均度值是12.5。图中节点越大表明度值越大。大于平均度值的活性成分有13个，分别是槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花黄素、淫羊藿苷元、豆甾醇、甘草查尔酮A、柚皮素、8-异戊烯基黄酮、维斯体素、8-甲雷杜辛、赝靛素。靶点有23个，分别是ESR2、PIK3CG、PPARG、CASP3、AKT1、MAPK1、JUN、TNF、ADRB2、ESR1、RXRA、PTGS2、NOS2、MAPK14、RELA、CDK2、GSK3B、BCL2、INSR、F2R、HSP90AA1、CCNA2。信号通路有16条，分别是PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路、雌激素信号通路、胰岛素信号通路、钙信号通路、破骨细胞分化信号通路、FoxO信号通路、toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、VEGF信号通路、AMPK信号通路、mTOR信号通路、Jak-STAT信号通路、PPAR信号通路。见图6。

图6 “活性成分-重要靶点-关键通路”网络

3 讨论

骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病。基于中医“肾藏精”“肾主骨”的理论，肾精亏虚是此病发生的基本病机，并与中医肝、脾等脏腑功能密切相关[11]。藤黄健骨胶囊既可补肾，又可活血止痛，全方配伍，临床疗效显著。但是，目前对藤黄健骨胶囊的研究主要集中在临床观察及少量成分研究方面，缺乏药理作用机制方面的研究。

基于中药多成分、多靶点的特殊性，为更加全面地研究藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症的作用机制，本研究通过网络药理学方法，系统构建藤黄健骨胶囊的“中药材-活性成分-靶点”网络及“关键成分-重要靶标-映射通路”网络，并进行深入挖掘分析。最终经筛选得到的药物关键成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花黄素、淫羊藿苷元等13个，关键靶点有ESR2、PIK3CG、PPARG、CASP3、AKT1、MAPK1、JUN、TNF等23个，映射的靶标通路有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路、胰岛素信号通路、钙信号通路等16条，涉及的生物过程有雌激素反应、细胞凋亡调节、细胞增殖分化、炎症级联反应、血管收缩调节等10余种。

本研究筛选出的藤黄健骨胶囊关键成分槲皮素可通过调控Smad4和BMP2来促进成骨细胞分化[12]；木犀草素可促进成骨细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达[13]；山奈酚可通过调节Ca2+代谢平衡，促进骨胶原生成，减少骨小梁丢失，对原发性骨质疏松起治疗作用[14]；β-谷甾醇可通过提高成骨细胞骨保护素与破骨细胞分化因子的比值和刺激卵巢颗粒细胞分泌雌二醇，从而促进和加强成骨作用[15]；芒柄花黄素与雌二醇具有相似的空间结构，且同样具有雌激素活性，被称为异黄酮植物雌激素，具有明显的抗炎和抗骨质疏松作用[16]；淫羊藿苷元可通过Hedgehog信号通路促进成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化[17]。除以上成分以外，还有多个其他成分，如甘草查尔酮A、柚皮素、8-异戊烯基黄酮等，可从不同方面、不同层次，通过相互配合、相互作用的途径综合发挥抗骨质疏松作用。

本研究显示，藤黄健骨胶囊的主要有效成分主要作用于ESR2、PIK3CG、PPARG、CASP3、AKT1、MAPK1、JUN、TNF等多个靶点，从而发挥抗骨质疏松作用。这些靶点主要映射在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路、雌激素信号通路、胰岛素信号通路、破骨细胞分化信号通路、钙信号通路等关键通路上，主要涉及以下类型通路。(1)炎症性信号通路：炎症是骨质疏松发生的重要独立危险因素，以上靶点及通路主要与各种炎症高度相关。PI3K/Akt、MAPK及NF-kappa B均是经典的炎症信号通路。骨组织中的各类信号分子能够选择性激活PI3K/Akt信号通路的相关基因，通过调控成骨细胞和破骨细胞的活动，破坏骨重建过程中骨形成与骨吸收的动态平衡，在骨质疏松的发生和发展中扮演非常重要的角色[18]。MAPK信号通路是生物体内重要的信号通路，其亚族主要包括JNK、ERK及p38，主要介导细胞的生长、分化等多种过程[19]。研究表明，MAPK信号通路对于破骨细胞的形成和活化具有重要作用，并且也能够通过影响NF-κB信号通路介导骨质疏松症的发展[20-21]。NF-κB信号通路在骨质疏松症的发展过程中具有关键性作用，可促进破骨细胞形成和活化相关信号分子的转录，从而造成骨质的流失和骨质疏松的发生[22-23]。(2)激素类信号通路：包括雌激素信号通路和胰岛素信号通路等。雌激素不仅能够参与破骨和成骨细胞的生理过程，且能够维持2种细胞能力的动态稳定平衡，影响间充质干细胞向成骨方向的增殖分化，雌激素缺乏可使破骨水平高于成骨，导致骨质疏松[24]。胰岛素信号通路对机体骨存量存在重要影响，研究显示肝源性胰岛素生长因子-1缺失后，小鼠骨体积明显变小，骨构塑过程明显受抑制，骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化增多，成骨细胞分化减少[25]。(3)钙离子信号通路与破骨细胞分化通路：破骨细胞的过度激活可导致骨质疏松，而抑制破骨细胞的分化及功能，减轻破骨细胞的过度激活，可有效抑制骨量丢失，从而发挥抗骨质疏松作用[26]。研究表明，通过CaV1.2通道增加钙离子信号可以促进骨形成并阻止由雌激素缺失导致的骨丢失，在成骨、软骨、骨髓基质细胞中通过激活CaV1.2可让更多的钙离子内流，促进骨的形成，并且抑制破骨细胞的分化，减少骨丢失[27]。

综上所述，藤黄健骨胶囊主要通过抑制炎症反应、激素调节及钙调节等关键信号通路，调控破骨细胞与成骨细胞动态平衡，调节骨代谢，从而起到抗骨质疏松的作用。藤黄健骨胶囊的分子靶点治疗网络机制复杂，本研究通过构建“药物-活性成分-靶点”网络及“关键成分-重要靶标-映射通路”网络，经数据系统分析后，筛选出核心活性成分及作用靶标，并进行生物学信息分析，预测藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松的复杂机制，为进一步的后续药理研究奠定了扎实的前期基础，也为更高效探究中药治疗复杂疾病的作用机制提供了科学的思路和方向。