环状RNA circ-STK39在肾癌中的表达及可能的调控通路分析

纪梓良，彭艳红，陈 忠，温志强，路瑞静

(1.南方医科大学深圳医院泌尿外科，广东深圳 518101；2.深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳 518133)

肾癌是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的3%。根据2017年的统计，肾癌已成为男性第6常见的恶性肿瘤，而在女性中发病率排名第10[1]。由于肾癌对放疗和化疗不敏感，晚期肾癌的5年生存率仍不到10%[2]。另外，目前缺乏有效的肿瘤标志物来早期诊断或监测肾癌的进展。因此，寻找理想的分子生物学标志物作为肾癌的预后预测和治疗靶点具有重要的临床意义。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是继微小RNA(microRNA，miRNA)及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)后，RNA家族又一新的内源性非编码RNA，对基因表达的调控有重要作用，并成为RNA领域的一个新的研究热点[3]。由于闭环结构，circRNA比线性RNA更稳定，更适合用作肿瘤标志物[4]。大量研究报道，circRNA在多种癌症(例如肺癌、骨肉瘤和前列腺癌)的发生和发展中起着关键作用[5-7]。在前期研究中，我们通过测序在肾癌中筛选了一系列异常表达的miRNA，其中miR-192-5p在肾癌中表达显著降低[8]。通过定量实时聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测45对肾癌和邻近正常肾脏标本，证实了miR-192-5p的表达下调，细胞功能实验表明miR-192-5p可以抑制肾癌细胞株的增殖、侵袭和迁移[9]。此外，我们使用高通量测序在肾癌中鉴定出21个显著上调和32个显著下调的circRNA，其中高表达的circ-STK39在生物信息学分析中显示存在与miR-192-5p相互结合的位点。本研究拟进一步检测circ-STK39在肾癌组织中的表达，探讨circ-STK39、miR-192-5p调控通路在肾癌中的作用及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源该研究得到南方医科大学深圳医院伦理委员会的批准和监督。所有患者均签署了书面知情同意书。收取南方医科大学深圳医院2019年1月至2020年3月期间手术切除的肾癌标本和邻近的正常肾组织。所有患者均无化疗、放疗或其他癌症的病史。其中取离肿瘤边缘>5 cm的组织作为相邻的正常肾组织。根据世界卫生组织分类系统进行组织病理学诊断，并根据Fuhrman分类系统对细胞核分级进行评分。

1.2 RNA提取和qRT-PCR使用Trizol试剂(Life Technologies，美国)从组织中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计(Isogen Life Science，荷兰)测量RNA样品的浓度和纯度。如果A260/A280的比率在1.8～2.1之间，则RNA样品的纯度合格。使用M-MLV逆转录酶试剂盒(Life Technologies，美国)，通过随机引物对总RNA进行逆转录。使用实时定量PCR系统(ABI 7500，Applied Biosystems，美国)和SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa，日本)来进行qRT-PCR反应。GAPDH被用作内源性对照基因。表1列出了用于qRT-PCR的引物。circRNA的相对表达水平用2-△△Ct表示。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 细胞培养人肾癌细胞系ACHN培养于含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco，美国)中，并在37 ℃含体积分数为5%的CO2培养箱中生长。

1.4 circ-STK39的Sanger测序及RNase R处理circ-STK39的Sanger测序由广州吉赛科技公司完成。从ACHN细胞系提取的RNA，加入RNase R(吉赛科技，广州)，按3 U/μg RNA配置成20 μL反应体系，37 ℃水浴30 min后进行qRT-PCR反应，检测circ-STK39及STK39 mRNA的相对表达量。

1.5 circRNA/miRNA/mRNA调控通路预测我们使用了RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw)[10]，circRNA Interactome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)[11]和StarBase(http：//starbase.sysu.edu.cn)[12]来预测circRNA/miRNA/mRNA的调控通路。使用MiRanda(http://www.microrna.org/microrna/)和Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72)预测相关miRNA的潜在靶基因。使用Cytoscape软件构建circRNA/miRNA/mRNA网络。

1.6 统计学分析circRNA表达差异采用配对的Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。使用接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线和ROC曲线下面积(area under curve，AUC)分析circRNA在临床中的诊断意义，所有图形均使用GraphPad Prism(v8.2.1)绘制。

2 结 果

2.1 临床标本资料收取南方医科大学深圳医院2019年1月至2020年3月期间手术切除的肾癌标本和邻近的正常肾组织共31例。平均年龄54岁，其中男性20例，女性11例。病理分型包括透明细胞癌27例，Xp11.2易位-TFE3基因融合相关性肾癌2例，嫌色细胞癌2例。临床分期大多为Ⅰ期，肿瘤分级大多为T1期，Fuhrman分级以G2级为主(表2)。

表2 患者的临床资料

2.2 生物信息学分析显示circ-STK39存在miR-192-5p潜在结合位点在前期筛选的肾癌中高表达的circRNA中，生物信息学分析发现hsa_circ_0005882(circ-STK39)存在miR-192-5p潜在结合位点(图1A)。STK39基因位于2号染色体，STK39 pre-mRNA长度为66 259 bp，包含外显子14、外显子13、外显子12、外显子11、外显子10、外显子9、内含子13、内含子12、内含子11、内含子10和内含子9。此后，circ-STK39剪切为仅包含外显子14、外显子13、外显子12、外显子11、外显子10和外显子9的闭环结构(图1B)。框1显示了STK39基因的GC百分率和100个脊椎动物的保守性(图1B，Box.1)。此外，通过Sanger测序验证了circRNA的特定反向剪接位点(图1B，Box.2)。

2.3 circ-STK39在肾癌组织中高表达为了进一步验证RNA测序的结果，我们应用qRT-PCR检测31对肾癌和邻近正常肾组织标本中circ-STK39的表达水平。如图2A、B所示，与匹配的正常肾组织相比，肾癌组织中circ-STK39的表达显著上调(P<0.001)。同时，经RNase R核酸外切酶处理后，RNase R未能消化circ-STK39，其表达量较对照组无明显差异。而STK39 mRNA表达却显著降低(图2C)。 结果表明circ-STK39存在环化结构，且不被RNase R核酸外切酶所降解，与mRNA相比，其在细胞内更为稳定。

A：circ-STK39和miR-192-5p之间的预测结合位点示意图；B：circ-STK39的基因特征示意图，STK39基因的GC百分率和100个脊椎动物保守性(Box.1)，Sanger测序验证了circ-STK39的反向剪接位点(Box.2)。

A、B：qRT-PCR结果显示circ-STK39在31个肾癌组织中较相邻正常肾脏组织表达明显升高；C：RNase R处理后，circ-STK39表达无变化；而线性STK39 mRNA表达显著下降。

2.4 circ-STK39可作为肾癌的潜在肿瘤标志物我们通过绘制ROC曲线，进一步评估了circ-STK39对肾癌的诊断价值。我们发现circ-STK39具有很高的诊断准确性，AUC为0.734(95%CI：0.610～0.857，P<0.01，图3)。敏感性和特异性分别为0.871和0.516。

2.5 circRNA/miRNA/mRNA调控网络的构建为了进一步研究circ-STK39的潜在生物学功能，我们利用生物信息学程序预测并构建了一个circRNA/miRNA/mRNA相互作用的网络图(图4)。该调控网络包含5个miRNA和25个mRNA，这可能有助于预测circRNA与目标基因之间的潜在调控联系。

图3 Circ-STK39的ROC曲线分析

图4 Circ-STK39/miRNA/mRNA调控网络图

3 讨 论

circRNA是近年来兴起的一个新的研究热点，越来越多的研究表明circRNA在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。circRNA的特征可归纳如下：①丰富性和多样性：circRNA在多种正常和恶性肿瘤细胞中广泛表达，其在特定疾病或组织细胞中的表达具有多样性；②稳定性：闭环结构使它们比线性RNA更稳定；③保守性：编码circRNA的基因在物种之间是高度保守的；④细胞定位：部分包含内含子的circRNA通常位于细胞核中，其余大多数成熟的circRNA位于细胞质中；⑤特异性：一些circRNA表现出疾病特异性表达，并可以作为潜在的生物标志物发挥作用[13]。circRNA分子富含miRNA应答元件，在细胞中起到miRNA海绵的作用，能够解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)机制。由于高通量测序技术和生物信息学分析的发展，circRNA在人类恶性肿瘤中的表达谱和潜在功能正逐渐被认识。

最近，越来越多的证据表明circRNA在肾癌发生发展中起重要作用。例如，HUANG等[14]发现在肾癌中上调的circPDK1通过调节miR-377-3P-NOTCH1轴来促进细胞迁移和侵袭；FENG等[15]报道了circRNA_001287能够靶向调控miR-144/CEP55的表达促进肾癌细胞的增殖；circ_0039569被证明可通过调节miR-34a-5p/CCL22促进肾癌细胞的增殖和转移[16]。在前期研究中，我们通过使用高通量测序在肾癌中鉴定出53个显著差异表达的circRNA(倍数变化≥2.0，P<0.05)，以及前期研究发现在肾癌中表达下调的miR-192-5p能够发挥抑癌的作用，抑制肾癌细胞的增殖、侵袭、迁移。因此我们试图寻找能够靶向调控miR-192-5p的circRNA。在21个上调的circRNA中，生物信息学分析提示circ-STK39能与miR-192-5p结合。

据我们所知，目前鲜有关于circ-STK39的研究，但已有大量研究表明miR-192-5p在各种人类恶性肿瘤中起着抑癌作用，尽管其潜在的分子机制未被完全阐明。ZOU等[17]发现miR-192-5p通过靶向调控TRIM44来抑制肺癌细胞的生物学行为。ZHOU等[18]报道了miR-192-5p通过靶向调控USP1抑制骨肉瘤的发生和发展。在本研究中，我们验证了在肾癌中，与miR-192-5p的低表达相反，circ-STK39在肾癌中显著高表达。生物信息学分析显示circ-STK39带有miR-192-5p 3非翻译区(3 untranslated region，3 UTR)的结合位点，提示circ-STK39能够通过海绵状吸附miR-192-5p从而调控其表达。此外，通过Sanger测序和RNase R处理验证了circ-STK39的特殊剪接位点和闭环稳定性。因此，我们有理由推测，miR-192-5p在肾癌中的抑癌作用可能与circ-STK39的miRNA海绵功能有关。后期需要进一步的研究，包括双荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀等实验以验证circ-STK39对miR-192-5p的调控作用。

如上所述，circRNA在某些癌症中稳定并特异性表达，这意味着它们适合作为肿瘤标志物。例如CHEN等[19]研究表明hsa_circ_0000190在诊断胃癌方面比癌胚抗原和癌抗原19-9具有更好的敏感性和特异性。YAO等[7]报道了在非小细胞肺癌中，circRNA-100876的上调与淋巴结转移和肿瘤分期密切相关。在本研究中，我们绘制了circ-STK39的ROC曲线，曲线下面积为0.734。结果表明，circ-STK39对肾癌的诊断及监测可能具有一定的临床意义。

到目前为止，肾癌中circRNA和miRNA相互作用的研究还很有限。因此，我们基于几种生物信息学程序构建了circRNA/miRNA/mRNA调控网络，可以帮助我们进一步了解circRNA在肾癌发生发展中的作用，预测其可能的调控通路。

综上所述，我们的研究验证了circ-STK39在肾癌中的高表达。生物信息学分析表明，高表达的circ-STK39可能与miR-192-5p的调控有关，并可能成为肾癌中的潜在分子标志物。后期除了扩大样本量检测外，仍需进一步验证circ-STK39对miR-192-5p的调控作用，并阐明circ-STK39在肾癌中的生物学功能和确切分子机制。