香叶木素对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡研究

张晓文，吕渊，鲁苗苗

（1.商洛学院 健康管理学院，陕西商洛 726000；2.陕西秦岭健康食品配料及核桃产业技术校企联合研究中心，陕西商洛 726000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种神经退行性疾病，静止性震颤、肌肉僵硬、运动缓慢和姿势反射紊乱为其临床四大主要症状，并伴有精神障碍症状，导致认知功能改变，精神状态异常[1]。帕金森病发病的分子机制被认为与线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡级联的激活有关。在中国，中老年人帕金森患病率高达67%，且每年呈上升趋势[2]，然而，针对该病的治疗目前仍没有理想方法，因此当前迫切需要探寻有效治疗帕金森病的药物和方法。中国传统医药被证明可以减轻帕金森病症状，对于控制病情发展，减少治疗的多巴胺用量具有一定的效果[3]。香叶木素是一种自豆类和橄榄叶中提取的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗雌激素、抗氧化剂、抗微生物和抗肿瘤等药理作用[4]。相关文献报道香叶木素具有抗细胞凋亡作用，可通过JNK通路诱导MCF-7细胞凋亡[5]，通过活化p38JNK信号通路促进鼻咽癌CNE2细胞凋亡[6]。已有研究表明香叶木素在体外研究中通过靶向α-Syn对帕金森病具有治疗潜力[7]。1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP+），已被广泛地用于体内或体外建立PD模型[8]。本文旨在研究香叶木素对MPP+诱导损伤的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞凋亡的影响，为临床治疗帕金森病提供新的思路、方法及依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

DHP-9002系恒温培养箱（上海飞越实验仪器有限公司）、MoFlo Astrios EQ流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）、MR-96A酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司）。

1.2 主要试剂

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）、香叶木素（中国食品药品检定研究院，化学式：C16H12O6，分子量：300.3， 含量：95.7%， 批号111788-200801）、MPP+（美国Sigma-Aldrich公司，纯度≥98%，批号 D048）、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培养基、胎牛血清、胰蛋白酶和青-链霉素（美国Gibco公司，批号分别为12100-046、10082-147、25200-056、15140-122）、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号G020-1-1）、CCK-8试剂盒、辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）、标记山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技术研究所，批号分别为C0037、A0208）、兔抗人α-突触核蛋白（α-Syn）单克隆抗体（ab6162）、兔抗人cleaved caspase-3单克隆抗体（ab2302）、兔抗人Ki67单克隆抗体（ab15580）、兔抗人STAT3单克隆抗体（ab5073）、兔抗人JAK单克隆抗体（ab47435）和兔抗β-actin单克隆抗体（英国Abcam公司，批号分别为 ab6162、ab2302、ab15580、ab5073、ab47435、ab8227）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞培养条件：培养基为高糖DMEM，内含10%胎牛血清和1%青-链霉素，培养温度为37℃，5% CO2恒温培养箱中培养。培养基每2 d更换1次。试验用细胞为对数生长期细胞。

1.3.2 MTT检测细胞活力

96孔板内，每空加入细胞100 μL后，再加入香叶木素（0，0.1，0.5，1，2，5，10，20，40，100 μmol·L－1），置于培养箱（温度37℃，含5% CO2）中持续培养24 h，每孔再加入50 μL培养液，孵育4 h后，吸出上清液，再加入DMSO 150 μL/孔，摇匀后在570 nm处检测各剂量OD值。在前期预试验中，当香叶木素剂量≤5 mg·kg－1时，细胞毒性作用不明显。基于此，本研究选取最高给药剂量为5 mg·kg－1， 倍数递减剂量确定给药梯度为5，2.5，1.25 mg·kg－1。

1.3.3 细胞处理与分组

取对数生长期SH-SY5Y细胞，将细胞随机分为 5 组：对照组（control）、模型组（MPP+）、香叶木素低剂量组（MPP++0.5）、香叶木素中剂量组（MPP++1）和香叶木素高剂量组（MPP++2）。对照组不作任何处理，MPP+组采用 1 mmol·L－1MPP+处理细胞 24 h，MPP++0.5 组采用 1 mmol·L－1MPP+和0.5 μmol·L－1香叶木素处理细胞 24 h，MPP++1 组采用 1 mmol·L－1MPP+和 1 μmol·L－1香 叶 木 素 处理细胞 24 h，MPP++2 组采用 1 mmol·L－1MPP+和 2 μmol·L－1香叶木素处理细胞 24 h[9]。

1.3.4 CCK-8试剂盒检测细胞活力

各组细胞处理后，连续培养SH-SY5Y细胞4 d，每天检测各组待测细胞的数量，绘制增殖倍数曲线。用培养基将CCK-8溶液稀释到10%，再用CCK-8溶液将待测细胞调整为1×106个/mL的细胞悬液，然后在37℃培养4 h，最后在450 nm处检测吸光度值，计算细胞增殖倍数。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞早期凋亡率

对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板中。37℃，含5% CO2培养箱中持续培养24 h后，处理方法同上述步骤1.3.3。收集细胞于1.5 mL EP管中，用预冷的PBS 缓冲液洗涤 3 次后，以 1000 r·min－1的速率离心5 min，然后弃去上清液，再用50 μL磷脂酰结合蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）结合液重悬细胞后，分别加入1 μL（Annexin V-FITC及2 μL碘化丙啶（PI）， 混匀，继续避光孵育20 min。各离心管内再加入150 μL预冷的PBS缓冲液，将其混匀后用流式细胞仪进行分析。

1.3.6 Western Blot

将各组细胞接种于6孔板中，每孔细胞加入1 mL RIPA裂解液，分别收集各组细胞，以16000 r·min－1离心 30 min， 再用 BCA 试剂盒进行蛋白质定量。随后100℃条件煮沸下变性5 min。通过SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件下加入兔抗人 α-Syn 单克隆抗体（1：1000）、兔抗人cleaved caspase-3单克隆抗体（1：1000）、 兔抗人Ki67单克隆抗体（1：1000）、兔抗人 STAT3单克隆抗体（1：1000）、兔抗人JAK单克隆抗体（1：1000）并孵育过夜，使用TBST清洗3次，每次10 min。在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：2000），孵育1 h后加入发光液，曝光处理。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对目的蛋白条带进行灰度分析，计算其与β-actin灰度值的比值，以表示目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学分析

本研究所有对比数据用SPSS21.0软件对试验数据进行统计学分析。数据表示为均数±标准差（±s），各组间比较采用方差分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 香叶木素不同剂量处理SH-SY5Y细胞24 h细胞活力的变化

采用MTT试剂盒检测SH-SY5Y细胞活力，香叶木素剂量在 10，40 μmol·L－1下，SH-SY5Y细胞活力极显著低于 0 μmol·L－1剂量（P＜0.01）。因此选取 0.5，1，2 μmol·L－1剂量香叶木素用于本研究的进一步试验。香叶木素对SH-SY5Y细胞24 h活力的影响结果见表1。

表1 香叶木素对SH-SY5Y细胞24h活力的影响

2.2 香叶木素增加细胞活性

采用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖倍数。香叶木素对SH-SY5Y细胞增殖活力的影响结果见表2。与对照组相比较，MPP+组细胞增殖倍数极显著降低（P＜0.01）。与MPP+组相比较，MPP++0.5、MPP++1和MPP++2组细胞活性极显著高于 MPP+组（P＜0.01）。

表2 香叶木素对SH-SY5Y细胞增殖活力的影响

2.3 香叶木素减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

为了检测香叶木素对MPP+处理的SH-SY5Y细胞凋亡的影响，本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果见图1和表3。与对照组相比较，MPP+组细胞早期凋亡率显著升高（P＜0.01）。与MPP+组相比较，处理组早期凋亡率依次降低，且极显著抑制MPP+处理的SH-SY5Y细胞凋亡（P＜0.01）。

图1 流式细胞术检测细胞凋亡

表3 香叶木素对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响

2.4 香叶木素抑制α-Syn、cleaved caspase-3蛋白表达，促进Ki67蛋白表达

采用 Western Blot检测 α-Syn、cleaved caspase-3、Ki67蛋白表达水平结果如图2和表4所示。与对照组相比较，MPP+组 α-Syn、cleaved caspase-3蛋白水平显著升高（P＜0.05）。与MPP+组相比较，MPP++0.5、MPP++1 和 MPP++2组α-Syn、cleaved caspase-3蛋白水平显著低于MPP+组（P＜0.05）；MPP+组 Ki67 蛋白水平显著低于对照组 （P＜0.05），MPP++0.5、MPP++1 和MPP++2组Ki67蛋白水平显著高于MPP+组（P＜0.05）。

图2 Western Blot法检测 α-Syn,cleaved caspase-3和Ki67蛋白表达水平

表4 α-Syn,cleaved caspase-3及 Ki67蛋白表达的降低情况

2.5 香叶木素激活JAK/STAT3信号通路

采用 Western Blot检测 JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平，结果如图3和表5所示。与对照组相比较，MPP+组p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白水平显著降低（P＜0.05）。与 MPP+组相比较，MPP++0.5、MPP++1、MPP++2组p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白水平显著高于 MPP+组（P＜0.05）。

图3 Western Blot法检测 JAK、p-JAK、STAT3 和p-STAT3蛋白表达水平

表5 香叶木素对JAK/STAT3信号通路的影响

3 讨论与结论

帕金森病是一种进行性神经退行性疾病，主要表现为震颤、僵硬、运动迟缓和步态障碍等形式的运动缺陷，主要归因于黑质致密部中多巴胺能神经元的逐渐丧失。因此，帕金森病当前治疗的策略主要针对多巴胺系统[10]。多巴胺替代治疗，目前在改善多巴胺依赖体征方面非常有效，特别是在疾病早期效果最佳[11]。了解帕金森病的潜在发病机制是神经保护疗法发展的关键，如氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和凋亡性细胞死亡等[12]，针对这些机制的一些药物已经证明在临床前研究中是有益的，但由于当前治疗方式的副作用明显，仍然需要找到一种药物或方法能够成功改变进行性疾病过程的疗法。

神经退行性疾病的发病机制非常复杂，生化途径中帕金森病存在多种潜在的药物靶点，因此针对“一种基因，一种药物，一种疾病”的常规药物发现方法，选取香叶木素作为治疗药物。Gai等[13]研究发现大补阴丸和牵正散通过促进细胞增殖改善MPP+诱导的帕金森病细胞模型。Ye等[3]研究发现肉苁蓉、黄芪和淫羊藿制作的中药制剂通过促进MES23.5多巴胺能细胞增殖起保护作用。本研究发现，香叶木素高浓度具有抑制SH-SY5Y细胞活力的作用，上调Ki67蛋白表达，且以剂量依赖的方式促进MPP+诱导的帕金森病细胞模型细胞增殖。

凋亡是一种细胞的程序性死亡过程，其在正常成年组织的早期发育及生长中发挥着重要的作用。凋亡是中枢神经系统正常发育过程中一种普遍存在的现象。然而，成年人大脑神经元的存活对其整个生命周期的正常功能更为重要。在帕金森病中，许多患者会出现神经元过度丢失或神经元死亡，所以，抑制神经元细胞凋亡是治疗帕金森病的有效方式。Zhao等[14]研究发现松果菊苷通过ROS/ATF3/CHOP途径调节保护SH-SY5Y细胞免受MPP+诱导的凋亡对帕金森病具有治疗作用。Gong等[15]研究鸢尾黄素酮可减弱MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，表明其对帕金森病有一定抑制作用。本研究结果与上述研究结果一致，香叶木素下调cleaved caspase-3蛋白表达，抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

α-Syn是由SNCA基因编码的14kDa天然未折叠蛋白，在脊椎动物物种中高度保守，并且小蛋白在大脑以及多个其他中央和外周组织中大量表达[16]。α-Syn是帕金森病的诊断标志物，α-Syn基因中的6个错义突变与帕金森病的发病机制有关， 包括 A30P、A53T、E46K、H50Q、G51D和A53E。这些突变体同种型的表达显着增加MPP+诱导的细胞毒性，说明α-Syn是帕金森病发病机制的核心参与者[17]。因此，减少α-Syn的形成或清除α-Syn是帕金森病治疗的合理策略。Liu等[18]研究发现，天麻钩藤饮通过降低α-Syn表达在帕金森病模型中具有神经保护作用。Hu等[19]研究发现，地骨皮甲素降低α-Syn表达对帕金森病具有神经保护治疗作用。本研究结果与上述研究结果一致，香叶木素可下调α-Syn蛋白表达。

JAK/STAT通路是大多数细胞传导细胞因子刺激信号的基本途径，与细胞增殖及凋亡密切相关[20]。JAK/STAT通路也是神经系统退行性疾病中神经细胞存活的重要蛋白通路，可作为中医药治疗帕金森病的重要切入点[21]。马一闻等[22]研究发现通过抑制JAK-STATs信号通路中p-STAT1和p-STAT3的激活抑制MPP+诱导的PC12细胞炎性因子的释放。本研究发现，香叶木素下调MPP+诱导损伤的SH-SY5Y细胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白表达，从而激活JAK/STAT3通路。

总之，本研究发现了香叶木素对MPP+损伤的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞的影响，香叶木素可以抑制细胞活力，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，下调 α-Syn、cleaved caspase-3蛋白表达，上调Ki67蛋白表达，下调p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白表达。在一定的剂量范围内，随着香叶木素浓度增加，其对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用显著增加。这种影响可能是通过激活JAK/STAT3通路实现的，香叶木素治疗帕金森病有较大的潜力。