乳腺癌组织中Notch1、Pim1及信号转导和转录激活因子3表达与患者生存的关系

陈建丽，张永喜，马国靖，吴 华，陈晓文，陈余英，蒋宇杰

(1.新乡医学院第三附属医院肿瘤内三科，河南 新乡 453003；2.广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东 湛江 524000；3.广东医科大学附属第二医院肿瘤科，广东 湛江 524000；4.广东农垦中心医院检验科，广东 湛江 524000)

乳腺癌是全球女性死亡的主要原因之一，能否有效地识别预后不良的乳腺癌患者并及早地采取干预措施具有非常重要的意义。目前，常用的乳腺癌预后评估指标往往存在特异性及准确性不高的缺点，寻找合适的标志物已成为研究的热点。Notch1、Pim1和信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)因与乳腺癌的密切相关性可能作为评估乳腺癌预后的潜在基因标志物。有研究发现，Pim1蛋白表达上调和Notch1信号通路激活促进了乳腺癌的发生及进展[1-5]，而STAT3上调可促进Pim1蛋白表达和Notch1信号激活[6-10]。但目前关于Notch1、STAT3和Pim1蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与预后的相关性研究甚少。本研究旨在探讨乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1表达与患者生存的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年1月至2014年12月新乡医学院第三附属医院和广东医科大学附属医院收治的80例乳腺癌患者为研究对象。纳入标准：(1)患者均行乳腺癌改良根治术；(2)术后经病理学检查确诊为乳腺浸润性导管癌；(3)年龄30～80岁。排除标准：(1)术前接受放射治疗、化学治疗或内分泌治疗的患者；(2)合并有其他严重疾病患者。本研究获得新乡医学院第三附属医院和广东医科大学附属医院人类伦理委员会批准，并获得了参与所有患者的书面同意。随访截止日期为2019年1月，生存期的计算从手术日期到随访结束日期或死亡日期。

1.2 主要试剂与仪器Pim1一抗购自美国Novus公司,STAT3一抗、鼠单克隆IgM-Notch1抗体购自美国Affinity公司，二抗鼠抗兔单克隆抗体购自美国Abcam公司，二甲苯购自汕头市西陇科学股份有限公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色液购自上海信帆生物科技有限公司，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、内源性过氧化物酶阻滞剂、苏木精均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 资料收集通过患者病历资料和原始病理报告收集可能影响乳腺癌进展及预后的临床和病理学参数，包括年龄、组织学分级(1、2、3级)、淋巴结转移(无或有)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与Ⅳ)、雌激素受体(estrogen receptor，ER)状态(阴性或阳性)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)状态(阴性或阳性)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)状态(阴性或阳性)以及辅助治疗方法(化学治疗、放射治疗和内分泌治疗)。

1.4 免疫组织化学染色法检测乳腺癌组织和癌旁组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达水平取所有患者术中切除的乳腺癌组织和癌旁组织(距癌组织4 cm以上的正常乳腺组织)固定后制作石蜡切片，使用二甲苯中脱蜡，并在梯度乙醇中水化。经脱蜡水化后的切片浸入柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复，自然冷却后使用磷酸盐缓冲溶液进行冲洗。在待测组织区域内滴加100 μL内源性过氧化物酶阻滞剂，室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲溶液冲洗。加入一抗Pim1(1100)、Notch1(1300)、STAT3(1800)，室温下孵育60 min。加入鼠抗兔单克隆抗体IgG作为二抗，室温下孵育15 min。最后，将组织切片用苏木精复染、梯度乙醇脱水、中性树胶封片后在显微镜下阅片。参考XIE等[11]和WU等[12]对免疫组织化学染色法结果的判读方法，计算阳性染色细胞的百分比和染色强度进行半定量评分。由2位病理医师显微镜下观察，采用双盲法进行独立评估。随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野连续计数100个细胞，计数阳性细胞数，计数后取平均值，并计算阳性细胞的百分比。Notch1、STAT3和Pim1蛋白阳性表达染色强度评分标准：阴性为0分、浅黄色为1分、黄色为2分、棕色为3分。阳性细胞百分比评分标准： ≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。Notch1、STAT3和Pim1蛋白相对表达水平评分为染色强度和阳性细胞百分比分值相乘，得分范围0～12分，≥4分为高表达，<4分为低表达。计数高表达和低表达的样本数并分别除以总样本数，分别获得高表达率和低表达率。

1.5 统计学处理应用SPSS 26.0软件进行数据统计与分析。计数资料用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman进行相关性分析；采用Kaplan-Meier法分析Pim1、Notch1、STAT3表达水平与患者生存期的关系；采用Cox回归分析临床病理特征及Notch1、Pim1和STAT3表达对生存期的影响；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌和癌旁组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达结果见表1和图1。Notch1和STAT3蛋白主要表达于细胞质中，Pim1蛋白主要表达于细胞核和(或)细胞质中。在乳腺癌组织中， Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表达率均显著高于低表达率，差异有统计学意义(χ2=24.711、4.056、2.205，P<0.05)。在癌旁组织中，Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表达率均显著低于低表达率，差异有统计学意义(χ2=38.042、16.039、16.437，P<0.05)。乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白高表达率均显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=76.306、97.605、83.265，P<0.05)。

表1 乳腺癌患者乳腺癌组织和癌旁组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达比较

图1 乳腺癌患者乳腺癌组织和癌旁组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

2.2 乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达水平与临床病理参数的相关性分析结果见表2。乳腺癌组织中STAT3表达水平与患者是否发生淋巴结转移有关(P<0.05)，Notch1、Pim1表达水平与患者是否发生淋巴结转移无关(P>0.05)。乳腺癌组织中Notch1、STAT3、Pim1表达水平与患者的ER状态有关(P<0.05)。乳腺癌组织中Notch1、STAT3、Pim1表达水平与患者的年龄、TNM分期、组织学分级、PR状态、HER2状态、辅助治疗方法无关(P>0.05)。

表2 Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达水平与临床病理变量的关系

2.3 乳腺癌患者乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1蛋白表达水平的相关性乳腺癌患者的乳腺癌组织中Notch1与Pim1、STAT3与Pim1、Notch1与Pim1蛋白表达水平均呈显著正相关(r=0.267、0.307、0.204，P<0.05)。

2.4 乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1表达水平与乳腺癌患者预后的关系结果见图2。Pim1高表达和低表达患者的中位生存期分别为61、62个月，Notch1高表达和低表达患者的中位生存期分别为58、61个月，STAT3高表达和低表达患者的中位生存期分别为57、70个月。Pim1高表达与低表达患者的中位生存期比较差异无统计学意义(χ2=1.927，P>0.05)。Notch1高表达与低表达患者的中位生存期比较差异无统计学意义(χ2=0.152，P>0.05)。STAT3高表达患者的中位生存期显著低于STAT3低表达患者，差异有统计学意义(χ2=11.154，P<0.05)。

A：Pim1；B：Notch1；C：STAT3。

2.5 乳腺癌患者多因素生存分析结果见表3。Cox多因素回归分析显示，年龄、组织学分级、TNM分期、淋巴结状态、ER状态、PR状态、Her-2状态及Notch1、Pim1、 STAT3蛋白表达水平与乳腺癌患者的生存期无显著相关性(P>0.05)。

表3 乳腺癌患者临床病理特征及Notch1、Pim1和 STAT3表达的Cox多因素生存分析

3 讨论

乳腺组织的癌变和进展由多条细胞信号传导通路参与调控，是发生遗传学改变的复杂过程，Notch1信号通路是其中研究较多的信号通路之一。Notch1信号通路激活与乳腺癌发生及进展密切相关[1-3]。DIÉVART等[13]研究发现，乳腺癌大鼠模型中Notch1为潜在癌基因。人乳腺癌组织中Notch1呈高表达且预示着肿瘤转移和生存状态较差[14-15]。Notch1信号通路激活可促进乳腺癌细胞发生上皮细胞间充质转换,促进乳腺癌的侵袭及转移[4]。本研究结果显示，乳腺癌组织中Notch1高表达率显著高于低表达率，且乳腺癌组织Notch1高表达率显著高于癌旁组织，证实Notch1信号激活促进了乳腺癌的发生及进展。

Pim家族编码产物Pim1蛋白激酶具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。Pim1可发挥多方面的生物学功能，在乳腺癌的发生及进展中扮演着促癌基因的角色[5]。Pim1的mRNA及蛋白水平在包括乳腺癌的大多数肿瘤中的表达异常上调。Pim1可降低乳腺癌细胞对药物治疗的敏感性[16]，还可导致针对人类表皮生长因子受体-2的靶向治疗出现耐药[17]。Pim1可参与微RNA-486-5p及骨髓细胞瘤病毒癌基因的调控，从而作用于乳腺肿瘤的发生和发展[18-19]。本研究结果显示，乳腺癌组织中Pim1高表达率显著高于低表达率，且乳腺癌组织Pim1高表达率显著高于癌旁组织，进一步证实Pim1异常表达与乳腺癌变密切相关。

目前，关于乳腺癌中Pim1表达上调与Notch1信号激活间关系很少被注意到。有研究表明，Pim1可通过磷酸化作用使乳腺癌细胞中Notch1胞内域转录活性增加，与单独抑制Pim1或Notch1治疗相比，同时抑制Pim1和Notch1能更有效地消除细胞反应[20]。本研究结果发现，Notch1与Pim1蛋白表达水平呈显著正相关，提示乳腺癌组织中Pim1表达上调与Notch1信号激活之间可能存在协同的促进作用。

STAT3是一种DNA结合蛋白，乳腺癌中普遍存在STAT3活性增强的现象，STAT3可促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭及上皮细胞间充质转换[6]。STAT3可能是乳腺癌中Pim1异常表达与Notch1信号传导间发生相互作用的关键因子。Notch1可通过调节STAT3促进乳腺癌细胞发生上皮细胞间充质转换以及维持乳腺癌干细胞特性[7-8]。有研究发现，在肿瘤细胞包括乳腺癌细胞中，Pim1的表达受c-Jun氨基末端激酶/STAT3信号通路调控[9-10]。本研究结果发现，乳腺癌组织中Notch1、STAT3和Pim1高表达率均显著高于低表达率，且Notch1、STAT3和Pim1高表达率均显著高于癌旁组织；此外，Spearman等级相关分析结果显示，乳腺癌患者的乳腺癌组织中Notch1与Pim1、STAT3与Pim1、Notch1与Pim1蛋白表达水平间均呈显著正相关；表明STAT3可能介导Notch1和Pim1的相互作用从而促进乳腺癌的发生及进展，针对上述基因的联合靶向治疗有望成为乳腺癌治疗的新的突破点。

ER也可能是Pim1与Notch1之间相互作用的关键因子。Notch1可增加ERα的转录活性[21]，同时雌激素也增加Notch1的表达水平[22]。有研究发现，Pim1是受ERα直接调控的一个靶基因[23]。本研究结果显示，乳腺癌组织中Notch1、STAT3、Pim1表达水平与患者的ER状态有关，提示Notch1、STAT3、Pim1高表达的乳腺癌患者使用靶向ER的内分泌治疗方法可能获得较好的疗效。

本研究通过Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，Pim1、 Notch1高表达与低表达患者的生存期比较差异无统计学意义，STAT3高表达患者的生存期显著低于STAT3低表达患者，提示STAT3高表达会导致乳腺癌患者生存期降低。此外，本研究通过COX模型多因素分析显示，年龄、组织学分级、TNM分期、淋巴结状态、ER状态、PR状态、Her-2状态及Notch1、Pim1、 STAT3蛋白表达水平与乳腺癌患者的生存期无显著相关性，均不是乳腺癌患者生存期缩短的独立预后因素，究其原因可能与样本量偏少、随访时间较短、乳腺癌患者术后5 a生存率较高等因素有关,提示Notch1、STAT3和Pim1的联合检测可能会在术后更长时间体现出其预后评估价值。

综上所述，Pim1与Notch1之间在乳腺癌发生及发展的过程中可能存在协同的促进作用，ER和STAT3可能是二者间发生作用的关键因子，但具体机制有待细胞学水平和动物实验进一步研究。Notch1、STAT3和Pim1等基因的联合检测在长期预后评估中可能具有一定的价值，这有待继续增加样本量以及更长时间随访的研究证实。