外周血环状RNA DLGAP4与类风湿关节炎合并心力衰竭的关系

高爱红 田伟

(1.陕西省核工业二一五医院心血管内科，陕西 咸阳 712000； 2.陕西省核工业二一五医院病理科，陕西 咸阳 712000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一类以持续性滑膜炎、全身性炎症及自身出现抗体为特征的结缔组织病[1]，在中国的发病率为0.3%～0.4%，好发于20～45岁，发展至晚期可导致关节强直和畸形，极大地影响患者的生活质量[2]。不仅如此，RA通常还会累及心血管系统，增加心血管疾病患病风险。有研究显示，RA患者心血管死亡率是一般人群的1.5倍，其中心力衰竭(heart failure，HF)是显著的致死因素[3]。HF作为一类心脏结构或功能受损而导致心室充盈和/或射血功能受损的综合征，是多种心血管疾病的终末阶段[4]，目前关于RA合并HF的有关研究较少。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类特殊的非编码RNA，由前体RNA可变剪接产生的一类不具有游离的5’端帽子和3’端poly(A)尾巴，以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，且不易被核酸外切酶RNaseR降解[5]。随着研究的不断深入发现，circRNA能通过与血管动脉粥样性疾病[6]、癌症[7]及自身免疫性疾病[8]等相关联的微小RNA(miRNA)相互作用进而调控疾病的发生和发展过程，提示circRNA及其相互作用的miRNA可能成为一类新的生物标志物或治疗靶点。有研究发现其能通过靶向负调控miR-143表达而改善缺血性脑卒中的损伤[9]。因此本研究通过检测RA合并HF患者、单纯RA患者及健康人外周血中circDLGAP4和miR-143水平，来分析circDLGAP4表达水平与RA合并HF的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取陕西省核工业二一五医院2017年8月—2019年8月期间收治的RA患者42例为研究对象。男性11例，女性31例，年龄25～67岁，平均(38.9±10.8)岁。均符合美国风湿病学会修订的RA分类标准[10]，HF诊断标准参考《美国心衰诊断及治疗指南》[11]，并符合纽约心脏病学会心功能分级Ⅱ～Ⅲ级。排除标准：(1)合并系统性急慢性感染或炎症性疾病；(2)合并恶性肿瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病；(4)合并严重心、肝、肾功能不全者。另选取同期进行体检的健康人30例为对照组，男性10例，女性20例，年龄23～70岁，平均(39.5±9.1)岁。所有入组对象均知情并签署同意书。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

RA患者于入院次日清晨(对照组于体检时)用EDTA-K2抗凝管采集外周血3 mL，低温条件下3 000 r/min离心10 min后收集上清，分为2份，1份保存于-20 ℃用于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的检测，另1份保存于-80 ℃用于RNA表达检测。

1.2.2 TNF-α和IL-6水平检测

利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血中TNF-α和IL-6水平，试剂盒由上海广锐生物科技有限公司提供，检测过程严格按照试剂盒操作说明进行。

1.2.3 circDLGAP4和miR-143相对表达水平检测

根据RNA提取试剂盒相关操作提取外周血上清中总RNA，凝胶电泳检测RNA完整后按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，反转录体系(10 μL)：2×miRNA反应混合液5 μL，0.1%BSA 1 μL，miRNA PrimeScript®RT酶混合物1 μL，总RNA 0.5 μL，去RNA酶ddH2O 2.5 μL；反应条件设置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。合成cDNA后，按照实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒说明书检测目的基因的相对表达量，PCR体系10 μL：SYBR®Prmix Ex TapⅡ(2×)5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。详细操作见试剂盒说明书。PCR反应参数设置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，每个样孔设置3个复孔。circDLGAP4上游引物：5’-CGAGACGGCTACTGGTTCCT-3’，下游引物：5’-GGTGGCGGGGTCTTCTTATAC-3’；miR-143上游引物：5’-GGTGCAGTGCTGCATCTCTGGT-3’，下游引物：5’-CAGAGATGCAGCACTGCACCTT-3’；内参基因GAPDH上游引物：5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’，下游引物：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’，引物委托上海生物信息技术研究中心合成。用2-△△Ct法计算表达量，重复实验3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 RA患者和对照组患者的实验室检测指标比较

RA组患者外周血中TNF-α和IL-6水平高于对照组，RA+HF组患者的TNF-α、IL-6水平高于RA组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 外周血中TNF-α和IL-6水平比较

2.2 RA患者和对照组患者外周血中circDLGAP4和miR-143表达水平比较

RA组患者外周血中miR-143水平高于对照组，circDLGAP4表达水平低于对照组，RA+HF组患者的miR-143水平高于RA组，circDLGAP4表达水平低于RA组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：a：与对照组比较，P<0.05；b：与RA组比较，P<0.05。图1 外周血中circDLGAP4和miR-143表达水平比较

2.3 circDLGAP4表达水平与TNF-α、IL-6和miR-143水平的相关性分析

Spearman相关分析结果显示：circDLGAP4表达水平与TNF-α、IL-6和miR-143均呈负相关(r=-0.520 7、-0.432 7和-0.756 7，P均<0.05)。见表2。

表2 circDLGAP4表达水平与TNF-α、IL-6、miR-143水平的相关性分析

2.4 circDLGAP4诊断RA合并HF的ROC分析

ROC结果显示：circDLGAP4诊断RA合并HF的AUC为0.772，95%CI为0.621～0.923，截断值为0.67时的敏感度为83.3%，特异度为73.3%。见图2，表3。

表3 circDLGAP4诊断RA合并HF的效能

图2 circDLGAP4诊断RA合并HF的ROC曲线

3 讨论

RA作为一种慢性自发性自身免疫疾病，其发病机制尚未完全阐明，但目前研究表示，RA是受遗传因素和环境因素共同作用、打破免疫系统平衡而导致的一类疾病[12]。RA患者的心血管损伤极为常见，其中HF、缺血性心脏病与RA心血管高病死率关系密切，与普通人相比RA发生HF的概率大约是其2倍[13]，但目前RA合并HF的病因及机制尚未完全阐明。由于HF的诊断多以临床症状或Framingham HF标准来进行，但RA患者通常伴随有肺部疾病或全身性疾病，而一些非特异性的水肿及呼吸困难等会被误诊为HF，心脏彩超和脑利尿钠肽在RA合并HF的诊断有较高参考价值，但检测较为麻烦[14-15]。因此寻找早期诊断及特异性高的血清分子标志物对RA合并HF患者的诊断及防治具有积极意义。circRNA在早期研究中被认为是一类剪接副产物或错误剪接而形成的一类低丰度RNA分子，但随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，发现circRNA与人类基因表达关系密切，并且具有广泛、高度稳定、时序和疾病特异性等生物学特征，提示其可能具有成为生物标志物或治疗靶点的潜在价值[16]。近年来有大量研究显示RA患者外周血单核细胞中circRNA表达异常[17]，例如Zheng等[18]利用微阵列芯片检测技术，发现在RA患者中，有255个circRNA表达显著上调，329个circRNA表达显著下调，同时验证了circRNA可能通过与下游靶基因参与到RA的氧化应激以及炎症反应，进而促进RA病情发展。circDLGAP4是由Discs大同源物关联蛋白家族DLGAP4基因8、9、10外显子反向剪接而成。本研究结果显示，RA组患者外周血中miR-143水平明显升高，而circDLGAP4水平显著降低，合并HF患者的外周血中miR-143水平以及circDLGAP4水平变化更显著，提示下调表达的circDLGAP4可能与RA合并HF密切相关。对外周血中炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平检测发现，RA合并HF患者的TNF-α和IL-6水平显著高于单纯RA患者，可能是因为高水平的TNF-α和IL-6能诱导内皮功能障碍，介导炎症性血管损伤，并保持促炎症状态，影响心肌功能从而增加HF发生风险。Yang等[19]研究表明，RA患者滑膜组织中miR-143表达水平显著升高，通过抑制miR-143表达能降低TNF-α处理刺激而导致Ras-MAPK信号通路激活。本研究初步推测circDLGAP4可能通过靶向负调控miR-143表达，调控下游炎症信号通路相关基因蛋白的表达，进而抑制RA引起的慢性炎症反应，降低HF发生的风险。Spearman相关性分析结果也证实了circDLGAP4表达水平与TNF-α、IL-6和miR-143均呈负相关，提示circDLGAP4降低可能与RA并发HF相关。为了进一步验证circDLGAP4诊断RA并发HF的价值，本研究采取了ROC分析，结果显示circDLGAP4诊断RA并发HF的AUC为0.772，具有一定的诊断效能，提示其具有成为RA并发HF分子标志物的潜力。

综上所述，本研究初步探索了外周血circDLGAP4表达水平与RA合并HF的关系，推测其可能通过靶向负调控miR-143而抑制体内炎症反应从而减少RA合并HF的发生风险，但本研究只对外周血中circDLGAP4表达水平进行了分析，在滑膜组织中circDLGAP4表达水平与RA合并HF的关系是否与外周血中表达水平一致，还需进一步研究证实。