干酪乳杆菌发酵制备酸奶味香精基料的研究

任文彬，李玉坤，汪薇，白卫东

(仲恺农业学院 食品轻工业学院，广州 510225)

奶味香精，也可以称作乳香香味剂或乳香香精，是食品工业中应用最为广泛的食品香精之一[1]，主要应用于乳制品、糖果、冷食、饮料、烘焙食品等的增香。香基也称基香剂或主香剂，因其不直接用于加香产品中，只作为香精的香气主要组分，所以是配制香精的基础，故称它为香精的半成品[2]。

奶味香精的乳风味主要来源于乳脂肪的分解。其次，蛋白质和乳糖通过化学反应、酶水解和微生物发酵作用产生的风味物质也是奶味香精乳风味的重要来源[3]。制备奶味香精的方法主要有化学法和生物法。化学法主要是根据已确认的香味物质,采用化学合成的方法制备单体香原料。

生物法制备奶味香精采用成本较低的奶作为原料，原料的利用率将近100%，整个生产过程对环境不会造成污染。生物法制备奶味香精又包括酶法和微生物发酵法[4-9]。

本研究利用干酪乳杆菌，对黄油在不同发酵体系中进行发酵，催化生成酸奶味香精基料，探讨工艺过程及合适的工艺条件，筛选出酸奶香味最好的酸奶味香精基料，为天然奶味香精的微生物法工业化生产提供了参考。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酪乳杆菌冻干粉：广东省微生物研究所；无盐黄油：上海乐厨食品有限公司；乳清粉：河南万邦实业有限公司；脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；乳糖：上海源叶生物科技有限公司。

石油醚、异丙醇、氢氧化钾、邻苯二甲酸氢钾、酚酞指示剂等均为市售分析纯。

1.1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZQZY-75CS振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；DSX-280手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

称取一定量的脱脂奶粉加入蒸馏水配制成浓度为10%的牛奶培养基，在高压灭菌锅中用115 ℃灭菌15 min，冷却至40 ℃左右，在无菌条件下，接种干酪乳杆菌的冻干粉，再在37 ℃，150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，经2～3次活化使其活力充分恢复后,放置于冰箱中备用。

1.2.2 发酵方法

称取一定重量的黄油添加一定配比的辅底物，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入适量活化好的干酪乳杆菌，于37 ℃，150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，得到成品。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，选取黄油与乳清粉比例、底物浓度、菌种接种量、发酵时间4个因素设计成4因素3水平进行试验，选用 L9(34)正交表。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 感官评价

随机选取感官评价小组成员中5人，组成本试验香精基料感官评价小组，对发酵所得的香精基料从奶香味强度、酸味强度、香气协调度和留香时间4个方面进行评分，评分结果为四者之和，总分为10分。香精基料感官评价标准见表2。

表2 酸奶味香精基料感官评价标准表Table 2 The sensory evaluation standard table for yogurt-flavor essence basic material

1.2.5 酸价的测定

根据国标GB 5009.229-2016《食品中酸价的测定》[10]中冷溶剂指示剂滴定法测定。

1.2.6 酥性饼干的制作1.2.6.1 工艺流程

原材料预处理→调制面团→辊轧→成型→烘烤→ 冷却→成品→感官评价。

1.2.6.2 饼干的制作

按照一定的比例称取配料(低筋小麦粉100 g、油33 g、糖33 g、盐0.5 g、水20 g、小苏打0.32 g、香基1 g)，先将糖和盐溶解在水中，然后加入油和香基，搅拌均匀，最后将小麦粉和小苏打一起筛入，和成光滑的面团。将面团分成15 g左右一个的小面团，搓圆、压扁，摆在烤盘上。170 ℃预热5 min，放入饼干烘烤20 min左右，取出冷却，得到成品。同时做一批不添加香基的空白试样。

1.2.7 数据分析

采用Excel和SPSS 16.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同辅底物对制备酸奶味香精基料的影响

以20%的黄油为底物，在此基础上添加不同的辅底物(乳清粉、奶粉、乳糖)，黄油与辅底物的质量比为2∶1，空白样品仅以黄油为底物，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入活化好的干酪乳杆菌，接种量为15%，于37 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分，结果见图1。

图1 不同辅底物对制备酸奶味香精基料的影响Fig.1 Effect of different auxiliary substrates on yogurt-flavor essence basic material

由图1可知，添加乳清粉所制得的香精基料感官评分值是最高的，此时酸奶风味较浓郁、宜人，略带甜香味，留香时间较长；以奶粉作为辅底物时，有明显的奶香味，但是酸味较淡，留香时间不长；而以乳糖为辅底物时，奶味淡而且略带有异味；空白样品则只具有极淡的奶香味。此外，添加乳清粉的样品与空白样品对比，添加乳清粉后得到的产物口感变得更加细腻、香滑，更加适口。因此，选择以乳清粉为辅底物进行后续研究。

2.2 黄油与乳清粉比例对制备酸奶味香精基料的影响

以20%的黄油为底物，添加不同比例的乳清粉作为辅底物，比例分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入活化好的干酪乳杆菌，接种量为15%，于37 ℃，150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分以及酸价的测定，结果见图2。

图2 黄油与乳清粉比例对制备酸奶味香精基料的影响Fig.2 Effect of ratio of butter to whey powder on yogurt-flavor essence basic material

黄油中的主要成分是脂肪，此外，还含有酸类、内酯类、酮类、醛类等挥发性物质，形成黄油的独特香气和香味[11]。而乳清粉中的成分主要含有乳糖以及少量的乳清蛋白。脂肪和挥发性成分中的酯类和内酯类物质可被干酪乳杆菌分解生成少量的中短脂肪酸，乳糖可被转化为葡萄糖、半乳糖甚至是乳酸，乳清蛋白也可被水解成肽或氨基酸等物质，从而丰富产物的香味成分，同时改善口感[12]。由图2可知，随着黄油与乳清粉质量比的增加，香精基料的酸价变化平缓，通过数据分析，黄油与乳清粉的质量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1制备的香精基料所测得的酸价两两之间并没有显著性差异(p>0.05)。可能的原因是黄油与乳清粉的混合物经干酪乳杆菌分解后，所得到的游离脂肪酸总含量并无太大区别。

由感官评分曲线可知，当黄油与乳清粉的质量比为1∶1时，香精基料的感官评分最高，酸奶风味浓郁，奶香味浓厚，协调性最好，留香时间最长；然而随着黄油与乳清粉的质量比增大，感官评分逐渐降低，增加至5∶1时，所制得的香精基料感官评分最低，奶味与酸味的协调性差且有刺鼻的气味产生；质量比再继续升高至7∶1时，感官评分又逐渐升高，此时由于黄油的量增加，乳清粉的量减少，香精基料的奶香味浓厚但是酸味淡，出现甜奶味，无其他异味。综合考虑黄油的价格比较昂贵，因此最适的黄油与乳清粉的比例为1∶1。

2.3 底物浓度对制备酸奶味香精基料的影响

在6个50 mL的三角瓶中添加适量的黄油作为底物，使黄油浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%，控制黄油与乳清粉的比例为1∶1，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入活化好的干酪乳杆菌，接种量为15%，于37 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分以及酸价的测定，结果见图3。

图3 底物浓度对制备酸奶味香精基料的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on yogurt-flavor essence basic material

由图3可知，随着底物浓度的增加，香精基料的酸价变化平缓，通过数据分析，黄油浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%制备的香精基料所测得的酸价两两之间并没有显著性差异(p>0.05)。可能的原因是黄油与乳清粉的混合物经干酪乳杆菌分解后，所得到的游离脂肪酸总含量并无太大区别。

由感官评分曲线可知，当底物浓度低于20%时，随着底物浓度的不断递增，所制得的香精基料感官评分明显提高。这可能是因为随着底物浓度的增加，黄油和乳清粉的含量增加，其被干酪乳杆菌分解后所产生的香味物质的量也逐渐增加，使酸奶味的浓郁度和纯度也随之提高。然而当底物浓度高于20%时，随着底物浓度的进一步增加，所产生的酸奶味香气强度并没有进一步提高，带有干酪的风味，掩盖了酸奶风味。可能是由于底物浓度过高对干酪乳杆菌产生了抑制作用。综合成本价格考虑，最佳的底物浓度为20%。

2.4 接种量对制备酸奶味香精基料的影响

以20%的黄油为底物，黄油与乳清粉比例为1∶1，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下选择不同的干酪乳杆菌接种量，其接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%，于37 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分以及酸价的测定，结果见图4。

图4 接种量对制备酸奶味香精基料的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on yogurt-flavor essence basic material

由图4可知，随着干酪乳杆菌接种量的增加，测定的香精基料的酸价逐渐提高，当接种量为5%和10%时，所测得的酸价没有显著性差异(p>0.05)；当接种量为15%时，样品的酸价与接种量为10%的样品酸价存在显著性差异(p<0.05)，而当接种量大于15%后差异开始减小。可能的原因是相同质量的黄油与乳清粉混合物随着干酪乳杆菌菌数的增加被分解得越彻底，得到的游离脂肪酸含量越高，所测得的酸价也就越高。

由感官评分曲线可知，当干酪乳杆菌接种量为15%时，所制得的香精基料的感官评分最高，此时，酸奶风味浓郁，奶香味浓厚，协调性最好，留香时间最长；当接种量低于15%时，随着接种量的增加，感官评分也随之提高，这可能是因为接种量少时，黄油与乳清粉的混合物被利用分解的少，导致香气成分的含量少，此时制备的香精基料保留较多黄油本身的香味，酸味不够；当接种量大于15%时，随着接种量的进一步增加，香精基料的酸味加重，与奶香味协调性差，甚至有异味产生，导致感官评分降低。综合考虑，选择干酪乳杆菌接种量为15%为宜。

2.5 发酵温度对制备酸奶味香精基料的影响

以20%的黄油为底物，黄油与乳清粉的比例为1∶1，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入活化好的干酪乳杆菌，接种量为15%，放置于不同温度的恒温振荡培养箱中，以150 r/min的转速培养24 h，其中温度分别为29，33，37，41，45 ℃，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分和酸价的测定，结果见图5。

图5 发酵温度对制备酸奶味香精基料的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on yogurt-flavor essence basic material

由图5可知，奶味香精基料的酸价随着温度的变化而变化，当发酵温度为37 ℃时，测得的酸价与其他温度相比均具有显著性差异(p<0.05)。当发酵温度小于37 ℃时，随着温度的上升，所测得的奶味香精基料的酸价也进一步提高；当发酵温度大于37 ℃时，随着温度的进一步上升，酸价的值反而下降。这可能是因为干酪乳杆菌的最适发酵温度为37 ℃，低于或高于这个温度，菌的代谢活力都较差，分解出的游离脂肪酸较少，因此酸价呈现先上升后下降的趋势。

由感官评分曲线可知，当发酵温度从27 ℃上升至37 ℃时，干酪乳杆菌的细胞代谢活力随之增强，所制得的酸奶味香精基料的感官评分明显提高。当温度从37 ℃继续上升时，由于温度过高，使得菌种细胞内的酶系和细胞器等受到一定的破坏，细胞的代谢功能明显下降，导致制得的香精基料酸奶风味变差，因此感官评分降低。因此，选择最适的发酵温度为37 ℃。

2.6 发酵时间对制备酸奶味香精基料的影响

以20%的黄油为底物，黄油与乳清粉比例为1∶1，再加入适量的蒸馏水于85 ℃水浴灭菌15 min，冷却至室温，在无菌条件下接入活化好的干酪乳杆菌，接种量为15%，于37 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中培养一定时间，培养时间分别为12，16，20，24，28 h，然后在85 ℃下恒温灭菌15 min，制成香精基料。对发酵产物进行感官评分以及酸价的测定，结果见图6。

图6 发酵时间对制备酸奶味香精基料的影响Fig.6 Effect of fermentation time on yogurt-flavor essence basic material

由图6可知，随着发酵时间的增长，所测得的奶味香精基料的酸价略微有变化，呈上升趋势，发酵时间为12 h和16 h所制备的样品测得的酸价不具有明显差异(p>0.05)，而当发酵时间超过20 h之后，样品测得的酸价与16 h时的均具有显著性差异(p<0.05)。这可能是因为在其他相同条件下，随着发酵时间的增长，黄油与乳清粉的混合物经干酪乳杆菌发酵分解后得到的游离脂肪酸含量随之增多。

由感官评分曲线可知，随着发酵时间的增长，所制得的香精基料的感官评分随之逐渐提高，当发酵时间达到28 h时，感官评分最高，酸奶风味浓郁，奶香味浓厚，协调性最好，留香时间最长。可能是由于随着发酵时间的增长，黄油与乳清粉的混合物被干酪乳杆菌发酵分解得越彻底，产生的香气成分越多，而且大部分乳糖都被分解成乳酸，使得酸味浓郁，与奶味协调性好，没有产生不良气味，因此感官评分高。综合各方面因素考虑，最佳的发酵时间为28 h。

2.7 正交试验及结果

2.7.1 正交试验

由表3 可知，最佳的工艺组合为 A3B2C2D2，即当底物浓度为25%，黄油与乳清粉比例为2∶1，菌种接种量为15%，发酵时间为28 h时，该工艺下干酪乳杆菌发酵制得的酸奶味香精基料风味最好。对试验数据进行方差分析，结果见表4。

表3 正交试验结果Table 3 The results oforthogonal test

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis

由表4可知，各因素对酸奶味香精基料的影响大小顺序为B>C>D>A，说明黄油与乳清粉的比例对该试验的影响最大，其次依次为菌种接种量、发酵时间，底物浓度对试验的影响最小。

2.7.2 验证试验

由于通过正交试验得出的最佳工艺条件不在正交设计的9个试验中，因此还需进行验证试验。以正交试验最佳工艺组合 A3B2C2D2进行试验和感官评价，其结果为8.5。

2.8 以酥性饼干为例的香精基料应用试验

对烘焙出来的饼干从外观、色泽、风味和留香等方面进行评价，评价结果见表5。

表5 烘焙饼干感官评价Table 5 The sensory evaluation for baked biscuit

3 结果与讨论

本试验通过以黄油为主要底物，搭配辅底物在不同条件下利用干酪乳杆菌对其进行发酵分解，生成天然酸奶味香精基料，最佳工艺条件：黄油与乳清粉的比例为2∶1，黄油浓度为25%，干酪乳杆菌的接种量为15%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为28 h。通过烘焙试验验证本产品能赋予饼干明显的酸奶味，持香较久。

通过食品级原料制备的天然奶味香精基料，不仅具有更好的香味和口感，赋予产品更加丰富的香气，而且赋予奶味香精产品丰富的营养成分，对消费者来说不仅安全，更有利于健康。