马钱子碱诱导人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡影响及作用机制研究

史雪丽，陈婷，苏胜，张丽娟

葡萄膜黑色素瘤多发于40～60 岁，是成人最常见的眼内原发恶性肿瘤。葡萄膜黑色素瘤起源于葡萄膜黑色素细胞，85%发生在脉络膜，多单侧发病，恶性度较高[1-2]。手术可以有效清除病灶，但是，对于癌细胞转移、复发或失去手术时机的晚期肿瘤患者，生物治疗可以有效控制肿瘤扩散，因此，寻找一种疗效好、副作用小、安全性高的治疗药物迫在眉睫。马钱子碱（brucine）为中药马钱子的主要生物碱单体，具有抑制免疫、杀菌消毒、抗炎镇痛、抗肿瘤等药理作用[3-4]。本研究拟在细胞水平进一步研究马钱子碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物

人眼葡萄膜黑色素瘤细胞UM90（美国ATCC公司），马钱子碱（美国Sigma 公司），二甲基亚砜、胎牛血清（杭州四季青公司），CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（南京建成生物研究所），苏木精-伊红（hematoxylin-Eosin staining，HE）染色液（北京索莱宝科技有限公司），Hoechst 33258 染色试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司），Annexin-V/PI 试剂盒（美国BD公司），BCA 蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物科技公司），PVDF 膜及化学发光试剂（南京建成生物研究所），Bax 及Bcl-2 抗体（北京中杉金桥公司）。

1.2 细胞培养

黑色素瘤细胞接种于含10%胎牛血清的1 640培养基（链霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL）中，培养箱CO2体积分数为5%，温度为37℃，每3 d 更换一次新鲜培养液。

1.3 黑色素瘤细胞分组

共分成4 组。（1）对照组（CG）：以正常培养液培养24 h。（2）马钱子碱组：依马钱子碱浓度不同分为3 个亚组。马钱子碱低浓度组（brucine low concentration group，BLG），马钱子碱中浓度组（brucine medium concentration group，BMG），马钱子碱高浓度组（brucine high concentration group，BHG）即在培养基中依次加入25、50、100 μg/mL 的马钱子培养液。培养48 h 后进行后续实验。

1.4 黑色素瘤细胞增殖能力检测

细胞接种于96 孔板中，细胞密度为1×105/mL，100 μL/孔，按照上述分组方法孵育24 h 后将培养液吸出，PBS 轻轻冲洗3 次，每孔分别加入20 μL 已配置含的10%CCK-8 溶液，37℃恒温箱中孵育1 h 后测定各孔450 nm 的吸光值。

1.5 HE 染色观察马钱子碱对黑色素瘤细胞形态的影响

上述分组后的细胞培养于载玻片上，95%乙醇固定细胞，苏木素染细胞核，伊红染细胞质，梯度酒精脱水后晾干，中性树胶封片。

1.6 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡

收集细胞并调整细胞密度至5×105个/mL，加入Hoechst 33258 染液混匀后室温避光孵育10 min，PBS 冲洗2 次后用波长为352 nm 的氪激光激发，倒置荧光显微镜下拍照。

1.7 Annexin V/PI 检测细胞凋亡

细胞培养于6 孔板中，每孔500 μL，细胞密度为1×105个/mL，磷酸缓冲液冲洗3 次，离心（1000 r/min）后重悬细胞并调整细胞数为1×106个/mL，黑暗中在室温下分别加入5 μL Annexin-V 和10 μLPI 染液，15 min 后流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 Western blot 法检测黑色素瘤细胞内Bax 及Bcl-2 的蛋白表达

提取蛋白质后以聚丙烯酰胺凝胶电泳，5%的脱脂奶粉溶液4℃封闭2 h，加一抗（稀释浓度1：1000）过夜，洗膜后室温下孵育二抗（稀释浓度1：2000）1 h，ECL 化学发光法自显影并采集图像，统计分析Bax及Bcl-2 的蛋白的相对表达率。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 进行统计分析。首先进行正态性检验及方差齐性检验。若数据符合正态分布，则采用均数标准差（）表示，两组组间比较采用LSD-t 法，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黑色素瘤细胞增殖率比较

4 组间比较，差异有统计学意义（F＝23.450，P＝0.000）。与CG 组比较，BLG 组、BMG 组及BHG 组细胞增殖率均下降，差异有统计学意义（tBLG＝7.964，PBLG＝0.000；tBMG＝12.920，PBMG＝0.000；tBHG＝20.962，PBHG＝0.000）。与BLG 组比较，BMG 组差异无统计学意义（P＞0.05），BHG 组差异有统计学意义（t＝10.720，P＝0.000）。与BMG 组比较，BHG 组差异有统计学意义（t＝6.291，P＝0.000）（表1）。

表1 马钱子碱对黑色素瘤细胞增殖率的影响（，n＝5）

表1 马钱子碱对黑色素瘤细胞增殖率的影响（，n＝5）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；# 与BLG 组比较；P＜0.05；&与BMG 组比较，P＜0.05。CG 对照组；BLG 马钱子碱低浓度组；BMG 马钱子碱中浓度组；BHG 马钱子碱高浓度组

2.2 马钱子碱对黑色素瘤细胞形态的影响

正常细胞的胞核被苏木精染成蓝色，细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色，马钱子碱作用于黑色素瘤细胞后，细胞密度减少，细胞间隙增大，马钱子碱中、高浓度组细胞核体积缩小明显（图1）。

图1 HE 染色观察马钱子碱对黑色素瘤细胞形态的影响（HE×400）。1A 对照组（CG）；1B 马钱子碱低浓度组（BLG）；1C 马钱子碱中浓度组（BMG）；1D 马钱子碱高浓度组（BHG）

2.3 黑色素瘤细胞凋亡的形态学观察

Hoechst 33258 染色剂可以进入凋亡细胞的细胞核，在荧光显微镜下，表现为致密颗粒状强荧光集聚（亮蓝色高荧光），以100 μg/mL 的马钱子碱组最为明显（图2）。

图2 黑色素瘤细胞凋亡的形态学观察（HE×200）。2A 对照组（CG）；2B 马钱子碱低浓度组（BLG）；2C 马钱子碱中浓度组（BMG）；2D 马钱子碱高浓度组（BHG）

2.4 黑色素瘤细胞凋亡率比较

4 组间比较，差异有统计学意义（F＝9.550，P＝0.000）。与CG 组比较，BLG 组、BMG 组及BHG 组细胞凋亡率逐渐增加，差异有统计学意义（tBLG＝7.982，PBLG＝0.000；tBMG＝12.744，PBMG＝0.000；tBHG＝15.960，PBHG＝0.000）。与BLG 组比较，BMG 组差异无统计学意义（P＞0.05），BHG 组差异有统计学意义（t＝6.940，P＝0.000）。与BMG 组比较，BHG 组差异无统计学意义（P＞0.05）。（图3、表2）

图3 流式细胞计数简单凋亡。3A 对照组（CG）；3B 马钱子碱低浓度组（BLG）；3C 马钱子碱中浓度组（BMG）；3D 马钱子碱高浓度组（BHG）

表2 马钱子碱对黑色素瘤细胞凋亡率的影响（，n＝5）

表2 马钱子碱对黑色素瘤细胞凋亡率的影响（，n＝5）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；# 与BLG 组比较；P＜0.05；&与BMG 组比较。CG 对照组；BLG 马钱子碱低浓度组；BMG 马钱子碱中浓度组；BHG 马钱子碱高浓度组

2.5 Bax 及Bcl-2 蛋白表达比较

Bax：4 组间比较，差异有统计学意义（F＝7.660，P＝0.000）。与CG 组比较，各组间差异有统计学意义（tBLG＝4.082，PBLG＝0.004；tBMG＝16.740，PBMG＝0.000；tBHG＝28.990，PBHG＝0.000）。与BLG 组比较，BMG 组差异有统计学意义（t=12.660,P=0.000），BHG 组差异有统计学意义（t＝23.680，P＝0.000）。与BMG 组比较，BHG组差异有统计学意义（t＝11.020，P＝0.000）（表3）。

Bcl-2：4 组间比较，差异有统计学意义（F＝11.210，P＝0.000）。与CG 组比较，各组间差异有统计学意义（tBLG＝6.678，PBLG＝0.000；tBMG＝9.080，PBMG＝0.000；tBHG＝10.079，PBHG＝0.000）。与BLG 组比较，BMG 组差异有统计学意义（t=10.340,P=0.000），BHG 组差异有统计学意义（t＝14.550，P＝0.000）。与BMG 组比较，BHG组差异有统计学意义（t＝3.674，P＝0.006）（表3）。

表3 各组Bax 及Bcl-2 蛋白相对表达比较（，n＝5）

表3 各组Bax 及Bcl-2 蛋白相对表达比较（，n＝5）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；# 与BLG 组比较，P＜0.05。CG 对照组；BLG 马钱子碱低浓度组；BMG 马钱子碱中浓度组；BHG 马钱子碱高浓度组

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤细胞恶性度高，易发生转移，治疗方法为手术与放疗、化疗结合，因为黑色素瘤具有很高的转移能力和侵袭性，手术和放疗很难避免病灶复发[5]。化疗药物通过血液循环到达全身各个组织，杀灭可能存在的微小转移灶，因此，化疗及靶向治疗在葡萄膜黑色素瘤的治疗中，逐渐发挥重要作用[6-7]。但是，化疗药物主要通过肝脏及肾脏代谢排出体外，传统化疗药物在发挥抗癌作用的同时，会将正常的细胞一并损害[8]。此外，化疗药物还存在降低免疫力、抑制造血功能、消化道不良反应等副作用，严重影响患者生活质量。

肿瘤细胞具有持续自我更新能力，通过无限增殖破坏正常的细胞组织，并抵抗化疗和放疗，这也是肿瘤疾病容易复发的原因[9]。中药在提高患者免疫能力的同时，也能减轻放化疗的副反应，其生物学疗效肯定。马钱子碱提取自马钱科植物的种子，是一种吲哚性生物碱，具有天然、低毒、高效、价格低廉的特征[3-4,10]。本研究中，CCK-8 结果显示，马钱子碱呈浓度依赖性抑制了黑色素瘤细胞的生长，说明该药物具有抑制肿瘤细胞生长的作用。判断细胞凋亡最直观方法为细胞形态学观察，本研究分别采用了HE染色法及Hoechst 33258 核染色法观察细胞形态。HE 染色结果显示，马钱子碱作用于黑色素瘤细胞后，细胞密度减少，细胞间隙增大，其中，马钱子碱中、高浓度组细胞核体积缩小明显。Hoechst 33258核染色结果显示，对照组细胞核未出现高荧光，马钱子碱处理后的黑色素瘤细胞呈现核浓缩的亮蓝色高荧光团块（细胞凋亡后出现了核固缩），上述两种形态学染色方法观察结果一致，有力的证明了马钱子碱具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。流式细胞技术是利用流式细胞仪在细胞分子水平上对单细胞进行定量分析的一种分选技术，马钱子碱处理后的黑色素瘤细胞凋亡比例明显下降，检测结果从另一个角度认证了马钱子碱对黑色素瘤细胞凋亡的促进作用。

机体组织通过凋亡反应清除异常细胞，既保证了生物体内环境的稳定，又促进了系统发育[11-12]。多种因素（衰老、药物、氧化损伤、射线）能够诱发凋亡反应，当机体正常的凋亡过程受到破坏或凋亡过程紊乱时，引发多种疾病，例如自身免疫性疾病及肿瘤[13]。Bcl-2 家族是线粒体凋亡途径中的重要调节因素[14]。本研究发现，马钱子碱诱导了黑色素瘤细胞Bax 蛋白表达上调，Bcl-2 蛋白表达下调。

总之，马钱子碱通过调节黑色素瘤细胞内Bax蛋白及Bcl-2 蛋白表达抑制黑色素瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。因此，马钱子碱有望成为治疗葡萄膜黑色素瘤的潜在性药物。