八宝眼膏对暴露性角膜炎大鼠治疗作用的研究

刘月，王玉巧，杨如萍，刘蔚，陆濛，周道年，明章银

八宝眼膏是一种具有清热退赤，止痒去翳等功效的中药软膏无菌制剂，药物组成为煅炉甘石、琥珀、麝香、牛黄、珍珠、冰片、硼砂、硵砂。临床上主要用于风火上扰所致的眼睛红肿痛痒、流泪、眼睑红烂等症状[1]。暴露性角膜炎是指角膜失去眼睑的保护而暴露于空气中，引起角膜干燥、上皮脱落，从而继发感染的角膜炎症[2]。本实验主要研究八宝眼膏对暴露性角膜炎大鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠，8 周龄，雄性，购买自武汉市疾病控制中心（实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018）。自由饮水，饮食，自然光照。所有大鼠适应性喂养1 周后进行实验。

1.2 实验药物及试剂

八宝眼膏（马应龙药业集团股份有限公司，批准文号：Z42021455）；维生素A 棕榈酸酯眼用凝胶（沈阳兴齐眼药股份有限公司，批准文号：H20073905）；4%多聚甲醛固定液（武汉谷歌生物科技有限公司）；柠檬酸（PH6.0）抗原修复液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；组化试剂盒DAB 显色液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Muc-5ac 多克隆抗体（Bioswamp）；山羊抗兔IgG HRP（辣根过氧化物酶标记兔二抗，Biosharp）。

1.3 动物分组及给药方法

将32 只SD 大鼠随机分成4 组，正常组、模型组、治疗组、阳性对照组，每组8 只（8 只眼）大鼠。

暴露性角膜炎模型：将大鼠麻醉后固定，用2-0/T缝合线将大鼠上下眼睑分别缝合固定在眼眶周围相应的皮肤上，使其不能正常瞬目[3]。制造模型6 d 后，开始给予不同处理，每日9:00 和17:00 各给药1 次，连续给药3 d。

给药方法：（1）正常组，不给予任何处理；（2）模型组，给予对应空白基质（凡士林）涂眼，每日2 次，每次0.15g；（3）治疗组，给予八宝眼膏涂眼，每日2 次，每次0.15g；（4）阳性对照组，给予维生素A 棕榈酸酯眼用凝胶涂眼，每日2 次，每次0.15 g。后3 组在连续给药3 d 后，进行后续实验。

1.4 观察指标

1.4.1 眼表变化情况 所有检查都在同一时间、地点，光照、温度等其他条件均相同，并且由同一人完成，保证各组实验条件一致。

1.4.2 Schirmer I 试验（schirmer I test，SⅠt）[4]采用购买的1 mm 宽泪液试纸条进行试验，用镊子将该试纸条置于大鼠下眼睑外侧穹窿部，纸条接触泪液时，颜色会成黄色，经过5 min 后测量从弯折处至变色终端的长度。

1.4.3 泪膜破裂时间（tear break-up time，BUT）[5]将大鼠麻醉后，放置于裂隙灯下，然后将大鼠的眼睛对准镜头，手动让大鼠瞬目1 次，然后拉开大鼠的上下眼睑，开始计时，然后观察大鼠眼角膜的泪膜，出现第1 个破裂点（1 个黑点或1 道裂痕）时停止计时，平均每只眼睛测3 次，记录平均值。

1.4.4 角结膜荧光素染色（fluorescein vital staining，FL）[6]用移液器取2%荧光素钠注射液30 μl 至大鼠下眼睑结膜囊内，手动让大鼠瞬目1 次，使得荧光素钠均匀的分布于大鼠的眼睛表面，在钴蓝色弥散光下检查大鼠眼表的染色情况，并拍照记录。评估标准，将角结膜分成角膜、上方球结膜、下方球结膜、颞侧结膜4 个部分，每个部分根据染色程度和面积然后再分为4 个等级，分值标准如下（表1）。评价标准：（1）阴性，总分值＜3 分；（2）弱阳性，3 分≤总分值≤6 分；（3）阳性，6 分≤总分值≤9 分；（4）强阳性，总分值≥9 分。

表1 大鼠角结膜荧光素钠染色分值标准

1.4.5 组织病理学 将大鼠颈椎脱臼处死后，取眼球，于4%多聚甲醛中固定，脱水包埋，进行常规HE 染色，在光镜下观察，并比较各组大鼠角膜结构的变化。

1.4.6 Muc-5ac 表达 按上述方法取结膜组织，4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，烤片，脱蜡，水化，抗原热修复，室温封闭30 min，一抗（工作浓度为1:100），4℃孵育过夜，PBS 清洗后加入二抗（工作浓度1:400），室温孵育50 min。之后DAB 显色，复染细胞核，然后脱水封片。以检测结膜杯状细胞胞浆中Muc-5ac 的表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS21.0 软件分析，计量资料以均数±标准差(）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用方差分析中LSD-t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼表情况和荧光素钠染色情况

造模6 d 后，正常组大鼠眼角膜、结膜润泽透亮，荧光素染色未着色；模型组大鼠眼角膜浑浊、干燥无光泽，角膜、结膜上皮片状荧光素着色（图1）。荧光素钠染色积分以及评价结果比较可以观察到正常组大鼠的角膜、上方球结膜、下方球结膜、颞侧结膜均没有荧光素着色，染色结果为阴性（0 分）；模型组大鼠角膜呈密集点状染色（2 分），颞侧结膜和上下球结膜为丝状、片状或块状染色（各3 分），染色结果为强阳性（共11 分）。

图1 各组大鼠眼表情况及荧光素染色情况。1A 正常组;1B 模型组；1C 治疗组，用药3 d 后；1D 阳性对照组，用药3 d 后

给药后角膜荧光染色：正常组、阳性对照组和治疗组大鼠的角膜、上方球结膜、下方球结膜、颞侧结膜均没有荧光素着色，染色结果为阴性（0 分）。模型组大鼠角膜有密集点状染色，颞侧结膜和球结膜为丝状、片状或块状染色，染色结果显示为强阳性（11 分）。

2.2 SⅠt

4 组间SⅠt（单位：mm/5 min）比较，有统计学意义（F=9.930，P=0.001）。两两比较，正常组（11.75±1.64）与模型组（7.88±1.29）相比，有统计学意义（t=4.686,P=0.000）；阳性对照组（11.5±1.66）、治疗组（11.5±1.80）与模型组比较，均有统计学意义（t阳性=4.246，t治疗=4.393；均P=0.001）。而阳性对照组与治疗组及正常组之间比较，无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 BUT

4 组间BUT（单位：s）比较，有统计学意义（F=80.941，P=0.000）。两两比较，正常组BUT（25.36±0.627）较模型组（10.78±0.949）高，差异有统计学意义（t=13.267,P=0.000）；阳性对照组（25.07±0.763）、治疗组（24.52±0.719）与模型组比较，均有统计学意义（t阳性=12.507，t治疗=14.877；均P=0.000）。而阳性对照组与治疗组及正常组之间比较，无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 组织病理学

正常组角膜HE 染色，各层清晰可见，表皮光滑完整，没有脱落，没有炎症细胞浸润；实质层细胞排列紧密，结构完整。模型组上皮层紊乱，排列不规则，实质层形态不规则并有部分丢失。治疗组、阳性对照组与模型组相比，其角膜组织结构的完整性都有所改善，上皮层细胞排列较为紧密，实质层细胞的形态也较为规则。治疗组实质层细胞排列更为紧密，结构也较为完整（图2）。

图2 用药3 d 后各组角膜组织切片HE 染色（×200）。2A 正常组；2B 模型组；2C 治疗组；2D 阳性对照组

2.5 Muc-5ac 表达

Muc-5ac 阳性表达在眼结膜组织杯状细胞的胞浆，为棕黄色颗粒状。Muc-5ac 阳性着色部位颜色越深，代表治疗效果愈好。正常组、治疗组、阳性对照组与模型组相比，Muc-5ac 阳性着色部位均呈现较深颜色（图3）。

图3 用药3d 后各组结膜Muc-5ac 单克隆抗体免疫组化染色（×100）。3A 正常组；3B 模型组；3C 治疗组；3D 阳性对照组

3 讨论

目前暴露性角膜炎临床缺乏特效药，一般主要采用红霉素眼膏、小牛血去蛋白提取物，妥布霉素眼膏，维生素A 棕榈酸钠等眼药对症支持治疗[7-8]。有文献[9]报道，柴芍大发散有一定作用，但仅应用于角膜溃疡,对于治疗暴露性角膜炎疗效欠佳。中医通常采用中药熏蒸，缓解干眼患者的症状。中药熏蒸操作方便，不经过体内肠肝循环代谢，毒副作用少，对眼部无不良刺激反应[10]。

八宝眼膏方中牛黄苦甘凉，有清肝解毒，化瘀开窍之功，对肝火上扰目窍所致眼疾皆属所宜，为君药。麝香辛香透达，能开窍避秽，解毒散瘀，以退目翳，为臣药。炉甘石、珍珠、琥珀、硼砂收湿敛疮，退赤去翳；硇砂消积软坚，破瘀散结，去恶疮目翳，共为佐药。冰片通诸窍，散郁火，去翳明目，故为使药。诸药合用，共奏清热退赤，止痒去翳之功。马应龙八宝眼霜可以通过抗炎、降低血流量的作用来改善黑眼圈[11]。推测八宝眼膏的某些成分有抗炎作用，从而修复角膜和结膜组织结构的损伤，使得结膜组织中杯状细胞的数目增加。杯状细胞分泌的粘蛋白能滋润眼表，稳定泪膜，从而改善暴露性角膜炎引发的一系列症状。

本研究发现八宝眼膏可以增加暴露性角膜炎模型大鼠的泪液分泌量，降低了角膜荧光素钠染色强度，延长泪膜破裂时间，增强泪膜稳定性，这些效应与阳性对照药维生素A 棕榈酸酯眼用凝胶相当。角膜组织HE 染色结果提示八宝眼膏能改善角膜的损伤，使上皮层细胞排列较为紧密，实质层细胞的形态亦较为规则，Muc-5ac 免疫组化结果说明八宝眼膏增加了杯状细胞Muc-5ac 表达，这可能是其增加泪液分泌量的原因之一。因此，认为八宝眼膏对暴露性结膜炎引起的角膜和结膜的损伤均有一定的修复作用。