Wnt通路中亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5/6在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及意义

李 宣，王文鹏，周 敏，徐晓蕊，高吉照

徐州医科大学附属医院儿科，江苏徐州 221002

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种恶性血液系统疾病，起源于B或T淋巴细胞在骨髓内的异常增殖，其发病机制暂不明确。ALL是儿童期最常见的肿瘤性疾病，其中以B-ALL最常见，约占儿童ALL的80%[1]。随着化疗方案的不断改进，ALL患儿的5年无病生存率可达80%[2]，但仍有一部分患儿出现耐药和复发，甚至死亡。Wnt/β-连环蛋白信号通路的异常激活与ALL的发病关系密切，富含亮氨酸重复序列G蛋白受体(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor，LGR)5/6是Wnt/β-连环蛋白信号通路中的重要因子，参与多种肿瘤的发生发展。本研究通过检测ALL患儿骨髓细胞中LGR5和LGR6 mRNA及蛋白的表达，探讨其在儿童ALL中的表达及意义。

对象和方法

对象选取2017年1月至2020年2月于徐州医科大学附属医院就诊的新发ALL和免疫性血小板减少症(immue thrombocytopenia，ITP)患儿为研究对象。ALL患儿入组标准：新发ALL患儿经诱导化疗第33天骨髓达完全缓解者。排除标准：(1)诱导缓解治疗期间放弃治疗、转外、死亡者；(2)经诱导化疗第33天骨髓未缓解者；(3)伴髓系标记者；(4)有其他恶性疾病者；(5)确诊前使用激素及其他免疫抑制剂者；(6)不同意入组者。纳入研究的ALL患儿39例，其中男22例、女17例，年龄1.4～12岁，平均年龄(6.2±3.6)岁。以治疗前作为初发组，经诱导化疗第33天骨髓达完全缓解时为缓解组；根据危险度分层再分为低危组(n=16)、中危组(n=9)和高危组(n=14)，ALL分层标准为与儿童ALL危险度相关的因素：包括(1)诊断时年龄<1岁或≥10岁；(2)诊断时外周血白细胞计数>50×109/L；(3)诊断时已发生中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia，CNSL)或睾丸白血病(testicular leukemia，TL)；(4)免疫表型为T系ALL；(5)细胞及分子遗传学特征：染色体数目<45的低二倍体、t(9；22)(q34；q11.2)/BCR-ABL1、t(4；11)(q21；q23)/MLL-AF4或其他MLL基因重排、t(1；19)(q23；p13)/E2A-PBX1；(6)泼尼松反应不良；(7)诱导缓解治疗第15天骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥25%；(8)微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)水平：诱导缓解治疗结束(化疗第33天)MRD≥1×10-4(本研究骨髓符合完全缓解标准)，或巩固治疗开始前(第12周)MRD≥1×10-3。在上述危险因素的基础上将儿童ALL的临床危险度分为3型：低危组：不具备上述任何一项危险因素者。中危组：具备以下任何1项或多项者：(1)诊断时年龄≥10岁或<1岁；(2)诊断时外周血白细胞计数≥50×109/L；(3)诊断时已发生CNSL和/或TL；(4)免疫表型为T系ALL；(5)t(1；19)(q23；p13)/E2A-PBX1阳性；(6)初诊危险度为低危，在诱导缓解治疗第15天骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥25%；(7)诱导缓解治疗末(第33天)MRD≥l×10-4，且<1×10-2。高危组：具备以下任何1项或多项者：(1)t(9；22)(q34；q11．2)/BCR-ABL1阳性；(2)t(4；11)(q21；q23)/MLL-AF4或其他MLL基因重排阳性；(3)泼尼松反应不良；(4)初诊危险度为中危经诱导缓解治疗第15天骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥25%；(5)诱导缓解治疗结束(化疗第33天)MRD>1×10-2(本研究骨髓符合完全缓解标准)，或巩固治疗开始前(第12周)MRD≥1×10-3[3]。ITP患儿30例纳入对照组，其中男20例、女10例，年龄0.3～12岁，平均年龄(4.6±3.5)岁。各组年龄和性别构成比差异无统计学意义。ALL患儿的诊断、危险度分层和诱导化疗方案依据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第4次修订)》[3]，ITP患儿的诊断依据《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》[4]。本研究获得本院伦理委员会批准(XZFY2020-KL153- 01)。

主要试剂与仪器淋巴细胞分离液(MP Biomedicals公司，美国)、TRIzol(Invitrogen 公司，美国)、cDNA第一链合成试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)、全蛋白抽提试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司)、BCA蛋白含量检测试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司)、兔抗-GAPDH(中国江苏凯基生物技术股份有限公司)、兔抗-LGR5(Abcamplc公司，英国)、兔抗-LGR6(Abcam公司，英国)，普通梯度PCR仪(美国ABI Veriti 96 well Thermal cycler)、Western blot检测试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司)、荧光定量PCR循环仪(ABI Step one plus Real time-PCR system，美国)、多功能酶标仪(MD Spectramac M3，美国)；引物由中国凯基生物技术股份有限公司设计合成。

标本制备分别取初发组、缓解组及对照组骨髓血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝，密度梯度离心法分离单个核细胞，磷酸盐平衡生理盐水(phosphate buffer saline，PBS)液洗涤3次，将单个核细胞和血浆分别移至不同EP管，-80 ℃冻存。

逆转录聚合酶链反应逆转录聚合酶链反应法检测骨髓细胞中LGR5和LGR6 mRNA表达水平。依据TRIzol说明书提取总RNA。取5 μl RNA至495 μl 1×TE缓冲液中，测定其在260 nm和 280 nm处吸光光密度(optical density，OD)值；OD260/OD280在1.8～2.1，提取的RNA的纯度很高，符合实验要求。依据cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。LGR5上游引物：5’-CATCAGCTATGTGCCCCCAA- 3’，下游引物：5’-AAAGCCTGGACGGGGATTTC- 3’，片段长度99 bp；LGR6上游引物：5’-ACCCCCTGACGGCTTACCT- 3’，下游引物：5’-GCTTGTCCTGGGATGTGTGAG- 3’，片段长度133 bp；GAPDH上游引物：5’-CAAATTCCATGGCACCGTCA- 3’，下游引物：5’-AGCATCGCCCCACTTGATTT- 3’，片段长度109 bp。扩增：往0.1 ml PCR管中依次加入如下组份：2×荧光探针10 μl、模板(cDNA稀释10倍)1 μl、引物混合(上游/下游各为10 μmol/L)2 μl、0.1% 超纯水7 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环；95 ℃变性15 s，骤冷至60 ℃，制作溶解曲线。

蛋白质印迹蛋白质印迹法检测骨髓单个核细胞中LGR5、LGR6蛋白表达水平。蛋白提取：PBS洗涤细胞2次；加入胰蛋白酶消化液，37 ℃消化后移至离心管中离心，再加入PBS离心洗涤2次；根据细胞数量加入裂解缓冲液(每1 ml冷裂解缓冲液加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂和5 μl 100 mol/L 苯甲基磺酰氟)，置于4 ℃摇床平台上，振荡15 min，离心15 min，取上清，分装保存于-70 ℃。蛋白定量：稀释待测样品总体积为20 μl，加入聚氰基丙烯酸正丁酯工作液200 μl，混匀后37 ℃放置30 min，在562 nm波长下比色，记录吸光值，通过标准曲线和样品的体积计算样品的蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳与转膜：吸取样品加入样品孔中，样品旁孔加入蛋白Marker；选择合适的电压水平，待目的条带进入凝胶最佳分离区(大约凝胶的2/3)时，停止电泳；切下目的条带转膜；转膜结束后，取出硝酸纤维素膜做好标记，用等渗缓冲盐溶液洗膜 5 min×3次。免疫印迹：将硝酸纤维素膜放入平皿中封闭；封闭结束后，用等渗缓冲盐溶液洗膜5 min×3次；将膜放入含一抗的平皿中，4 ℃摇床振荡孵育过夜；第2天取出，室温振荡30 min，吸弃一抗，TBST洗膜10 min×3次；加入稀释的二抗，室温摇床振荡反应2 h；结束后，回收二抗，TBST洗膜5 min×3次。取出硝酸纤维素膜，滴加工作液(EcL化学发光试剂盒中的A、B两种液体按1∶1等体积混合)，用保鲜膜覆盖。使用G：BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

统计学处理采用SPSS 24.0 统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验判断正态性，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，初发组、缓解组与对照组比较采用独立样本t检验，初发组与缓解组比较采用配对t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较方差齐时采用LSD法并作Bonferroni校正，方差不齐时采用Dunnett’ T3法[5]。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

LGR5和LGR6的mRNA表达初发组LGR5 mRNA的相对表达低于缓解组(t=-12.921，P=0.000)和对照组(t=-7.954，P=0.000)，差异有统计学意义；缓解组和对照组之间LGR5 mRNA的相对表达差异无统计学意义(t=-1.396，P=0.167)(表1)。初发组低危、中危、高危组LGR5 mRNA的相对表达不同，差异有统计学意义(F=5.057，P=0.012)，其中低危患儿LGR5 mRNA的相对表达高于中危(P=0.038)和高危(P=0.030)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿LGR5 mRNA的相对表达差异无统计学意义(P=1.000)；缓解组低危、中危、高危组LGR5 mRNA的相对表达不同，差异有统计学意义(F=5.034，P=0.012)，其中低危患儿LGR5 mRNA的相对表达高于中危(P=0.039)和高危(P=0.030)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿LGR5 mRNA的相对表达差异无统计学意义(P=1.000)(表2)。

初发组LGR6 mRNA的相对表达高于缓解组(t=12.532，P=0.000)和对照组(t=7.658，P=0.000)，差异有统计学意义；缓解组和对照组之间的LGR6 mRNA的相对表达差异无统计学意义(t=-0.450，P=0.654)(表1)。初发组低危、中危、高危组LGR6 mRNA的相对表达不同，差异有统计学意义(F=4.688，P=0.016)，其中低危患儿LGR6 mRNA的相对表达低于中危(P=0.045)和高危(P=0.042)患儿，差异有统计学意义，中危和高危患儿LGR6 mRNA的相对表达差异无统计学意义(P=1.000)；缓解组低危、中危、高危组LGR6 mRNA的相对表达不同，差异有统计学意义(F=5.628，P=0.007)，其中低危患儿LGR6 mRNA的相对表达低于中危(P=0.026)和高危(P=0.021)患儿，差异有统计学意义，中危和高危患儿LGR6 mRNA的相对表达差异无统计学意义(P=1.000)(表2)。

LGR5和LGR6的蛋白表达初发组LGR5 蛋白的相对表达低于缓解组(t=-6.864，P=0.000)和对照组(t=-6.404，P=0.000)，差异有统计学意义；缓解组和对照组LGR5蛋白的相对表达差异无统计学意义(t=-0.884，P=0.380)(表1、图1)。初发组低危、中危、高危组LGR5蛋白的相对表达不同，差异有统计学意义(F=4.632，P=0.016)，其中低危患儿LGR5蛋白的相对表达高于中危(P=0.045)和高危(P=0.045)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿之间LGR5蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(P=1.000)；缓解组低危、中危、高危组LGR5蛋白的相对表达不同，差异有统计学意义(F=45.969，P=0.006)，其中低危患儿LGR5 蛋白的相对表达高于中危(P=0.034)和高危(P=0.011)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿之间LGR5蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(P=1.000)(表3、图1)。

初发组LGR6蛋白的相对表达高于缓解组(t=23.508，P=0.000)和对照组(t=13.075，P=0.000)，差异有统计学意义；缓解组和对照组LGR6蛋白的相对表达差异无统计学意义(t=1.845，P=0.069)(表1)。初发组低危、中危、高危组LGR6蛋白的相对表达不同，差异有统计学意义(F=6.368，P=0.004)，其中低危患儿LGR6蛋白的相对表达低于中危(P=0.020)和高危(P=0.011)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿LGR6蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(P=1.000)；缓解组低危、中危、高危组LGR6蛋白的相对表达不同，差异有统计学意义(F=5.750，P=0.007)，其中低危患儿LGR6蛋白的相对表达低于中危(P=0.023)和高危(P=0.020)患儿，差异有统计学意义；中危和高危患儿LGR6蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(P=1.000)(表3、图2)。

表1 各组LGR5和LGR6 mRNA和蛋白的相对表达

表2 各危险度分组中LGR5和LGR6 mRNA的相对表达

表3 各危险度分组中LGR5和LGR6蛋白的相对表达

Mr：相对分子质量；1：缓解组；2：中危初发组；3：低危初发组；4：高危初发组；5：对照组

1：缓解组；2：中危初发组；3：低危初发组；4：高危初发组；5：对照组

讨 论

Wnt信号通路在进化过程中高度保守，在调节细胞增殖、迁移、凋亡和分化及调控正常组织重建等生命活动中发挥重要的作用，Wnt信号通路有多条途径，其中研究最为广泛的是经典Wnt信号通路，亦称为Wnt/β-连环蛋白通路[6]。当细胞外存在Wnt信号时，Wnt配体蛋白与受体结合，并募集散乱蛋白与细胞膜上的卷曲蛋白受体(frizzled，Fz)结合，使糖原合成激酶- 3β-支架蛋白-大肠腺瘤息肉蛋白-酪蛋白激酶1降解复合体无法降解胞质内的β-连环蛋白，使β-连环蛋白在胞内累积并进入细胞核，与核内T细胞因子/淋巴样增强因子结合，从而调控下游靶基因的转录。有研究显示，在ALL患儿中β-连环蛋白表达水平明显高于非恶性血液病患儿[7]，因此，Wnt/β-连环蛋白信号通路的异常激活与儿童ALL的发病关系密切。

LGR是一种7次跨膜受体，分为A、B、C 3个亚型，其中参与Wnt/β-连环蛋白信号通路的B型受体家族只有3种密切相关的受体即LGR4、LGR5、LGR6[8]，B型受体在多种肿瘤的发病中具有重要作用，尤其是LGR5和LGR6被认为是癌症干细胞的标志物。LGR5和LGR6是特异性顶部盘状底板反应蛋白(R-spondins，RSPOs)的特异性配体，RSPOs通过LGR与锌环指3(zinc and ring finger 3，ZNRF3)和环指蛋白43(ring finger protein 43，RNF43)结合，抑制ZNRF3/RNF43的泛素连接酶活性，使FZ受体在质膜上积聚，从而促进Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活[9- 10]。有研究显示Fz4在ALL患儿中表达增高，可能通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，参与儿童ALL的发病[5]。因此，LGR5、LGR6作为具有特定配体的Wnt/β-连环蛋白信号通路中的相关受体，可能成为独特的治疗靶标。

虽然LGR5与LGR6在序列上有50%的同源性[11]，但是LGR5和LGR6在不同肿瘤中发挥不同作用。有研究表明LGR5的高表达对胶质瘤细胞的克隆和致瘤能力非常重要[12]。另外，在脑胶质瘤细胞中，LGR5可以通过抑制β-连环蛋白的磷酸化激活Wnt/β-连环蛋白通路，使LGR5阳性的细胞具有更高的侵袭性和转移性[13]。因此，在脑胶质瘤中LGR5发挥促癌作用。但是，Cosgun等[14- 16]通过小鼠实验发现，当LGR5在B-ALL细胞中缺失时，核内β-连环蛋白大量积累并且其下游靶基因的表达也增加，表明在B细胞环境中LGR5是Wnt/β-连环蛋白信号通路的重要负调控因子。但LGR5发挥负向调控作用的机制暂不清楚，可能通过减少Wnt/FZ复合物对脂蛋白受体5/6的进入引起，但也可能是RSPOs通过LGR5与ZNRF3/RNF43结合触发更多的间接作用，其具体机制有待进一步研究。本研究显示，初发组LGR5 mRNA和蛋白的相对表达均低于缓解组和对照组；在儿童ALL中，低危患儿LGR5 mRNA和蛋白的相对表达均高于中危和高危患儿。因此，本研究认为在儿童ALL中，LGR5在Wnt/β-连环蛋白信号通路中发挥负向调控作用，LGR5的低表达使Wnt/β-连环蛋白信号通路异常激活，从而参与儿童ALL的发病，并且其表达变化与儿童ALL的危险度分层和治疗效果关系密切。

有研究指出，LGR6在卵巢癌及食管癌中表达水平增高，认为LGR6高表达导致Wnt/β-连环蛋白信号通路异常激活，促进肿瘤的发生发展进程[17- 18]。本研究显示，初发组LGR6 mRNA和蛋白的相对表达均高于缓解组和对照组，在儿童ALL中，低危患儿LGR5 mRNA和蛋白的相对表达均高于中危和高危患儿。并且，另有研究显示，FZ4在初发组表达均明显高于缓解组和对照组，在低危患儿中表达均低于中危和高危患儿[11]。因此，在儿童ALL中LGR6通过与RSPOs和ZNRF3/RNF43结合，使FZ受体在膜上积聚，从而在Wnt/β-连环蛋白信号通路中发挥正向调控作用，参与儿童ALL的发病。但也有研究认为LGR6为肿瘤抑制因子[19- 20]。LGR5和LGR6在肿瘤中发挥正向调控作用，是因为其与RSPOs配体和ZNRF3/RNF43结合，使FZ在胞膜上累积，导致Wnt/β-连环蛋白信号通路异常激活。但其在肿瘤中发挥抑癌作用的机制暂不明确。总之，LGR5和LGR6在肿瘤发生过程中的作用可能是其生物学功能整合的结果，可能与细胞环境、RSPOs家族成员的表达方式及相互作用有关，其在不同类型的肿瘤进展过程中可能发挥复杂甚至相反的作用。

综上，本研究表明在儿童ALL中，LGR5在Wnt/β-连环蛋白信号通路中发挥负向调控作用，LGR6在Wnt/β-连环蛋白信号通路中发挥正向调控作用，LGR5低表达和LGR6高表达，使Wnt/β-连环蛋白信号通路异常激活，参与儿童ALL的发病。LGR5和LGR6表达水平的变化可能与儿童ALL危险度分层和治疗效果关系密切。并且已有研究通过小鼠实验发现，LGR5-单甲基阿司他丁单药治疗可显著降低B-ALL的负担，地塞米松处理不仅增强LGR5在细胞表面的持续表达，而且增强LGR5-单甲基阿司他丁的疗效，并且认为LGR5是根除白血病起始细胞的一个很有前途的靶点[15- 16]。因此，检测LGR5和LGR6表达水平的变化对判断儿童ALL的发病、危险分层及治疗效果有一定意义，LGR5和LGR6有望成为治疗儿童ALL的靶点，可能为儿童ALL的治疗提供新的方法。