胡黄连苷 Ⅱ 通过MEK/ERK通路抑制食管癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究Δ

杨 谦，张 军，马玉泉，谭雪敏

(邯郸市中心医院胸外二科，河北 邯郸 056000)

食管癌是指来源于食管上皮的恶性肿瘤，常伴有体重严重下降、呕血及便血等不良症状，是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，若发生转移或侵袭临近器官，将会对患者的生命健康造成威胁[1]。目前，临床常用手术、化疗和放疗等方法缓解食管癌，但预后效果较差，生存率较低[2]。恶性肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭是恶性肿瘤发展的重要因素，因此，探讨新型药物对于食管癌的治疗具有重要意义。胡黄连苷是中药胡黄连中的一种有效成分，为环烯醚萜类化合物，具有肝脏保护[3]、神经保护[4]和抗炎[5]等多种生物活性。胡黄连苷Ⅱ是胡黄连苷单体有效成分之一，资料显示其能显著抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭及肿瘤血管生成，并认为胡黄连苷Ⅱ具有潜在的恶性肿瘤治疗作用[6]。但关于其具体机制尚不清晰。研究结果表明，丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen extracellular signal regulated kinase，MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)信号通路在细胞的增殖、分化、侵袭和迁移过程中发挥重要作用，激活的MEK可使ERK磷酸化，进而调节细胞功能，加速细胞增殖，最终导致肿瘤的形成与发展[7-8]。推测胡黄连苷Ⅱ和MEK/ERK通路之间可能存在一定的关联。目前关于胡黄连苷Ⅱ对食管癌的治疗作用研究较少，本研究通过培养人食管癌细胞，探讨胡黄连苷Ⅱ抑制食管癌细胞增殖、侵袭及迁移的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：MCO-15AC型CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)；XElx800型酶标仪(美国Perkin Elmer公司)；NC-100型细胞计数器(丹麦Chemimetec公司)；Accuri C6型流式细胞仪(美国BD公司)；TS100型倒置显微镜(日本Nikon公司)；GIS-500型凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司)。

1.1.2 实验细胞及药物：人食管癌Eca109细胞(批号：XY-XB-1075)购自美国菌种保藏中心。

1.1.3 药品与试剂：胡黄连苷Ⅱ(原料药，纯度≥98%，批号：39012-20-9)购自上海同田生物技术有限公司；MEK/ERK信号通路激活剂(美国MedChemexpress公司，批号：HY-12028)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡双染试剂盒、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)试剂(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号分别为P-CA-201、SA-209)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及四唑盐(MTT)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为P1400、T1300、R1200及M1020)；RIPA裂解液、蛋白提取试剂盒及BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天公司，批号分别为P0013C、P0027及P0011)；鼠抗人B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、MEK、磷酸化MEK(p-MEK)、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)及β-肌动蛋白(β-actin)一抗(武汉菲恩生物科技有限公司，批号分别为FNab00809、FNab00840、FNab09147、FNab03527、FNab01553、FNab05113、FNab02844及FNab00032)；鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白D3(cyclinD3)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-c-Raf)一抗及鼠抗人IgG二抗(美国Abcam公司，批号分别为ab13847、ab16663、ab183338、ab42596及ab150077)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及含药培养液制备：将食管癌Eca109细胞株快速融化，在离心管中反复吹打至细胞充分悬浮后接种于培养瓶，用含10% FBS的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养；细胞长满培养瓶后进行消化传代，用0.25%胰蛋白酶进行消化，消化至细胞变圆、即将从瓶壁脱落时停止消化并继续培养，取对数生长期细胞进行实验。胡黄连苷Ⅱ用无血清培养液溶解，配置成浓度为0、5、10、20、40及60 μmol/L的含药培养液。

1.2.2 胡黄连苷Ⅱ对食管癌Eca109细胞增殖的影响：收集对数生长期细胞，分别用0、5、10、20、40及60 μmol/L的含药培养液培养食管癌Eca细胞48 h，用MTT试剂盒检测细胞增殖情况，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，培养4 h后吸去上清液，加入二甲基亚砜150 μl，摇匀后于酶标仪中测定吸光度记为A实验，同时设置对照孔(含细胞、培养基及MTT溶液，不含药物)及空白孔(含培养基、MTT溶液，不含药物和细胞)，计算细胞增殖抑制率(%)=[(A对照-A实验)/(A对照-A空白)]×100%。每组5个复孔，实验重复3次(n=3)。选取对食管癌Eca109细胞增殖抑制率较强的含药培养液进行后续实验。

1.2.3 细胞分组及处理：收集对数生长期细胞，分为正常培养组(不加药物，常规培养)、胡黄连苷Ⅱ组(20 μmol/L胡黄连苷Ⅱ含药培养液200 μl)、激活剂组(等量20 μmol/L MEK/ERK信号通路激活剂)及胡黄连苷Ⅱ+激活剂组(等量20 μmol/L胡黄连苷Ⅱ含药培养液+20 μmol/L MEK/ERK信号通路激活剂)，于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养48 h后，收集四组细胞进行实验。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性：采用MTT法检测四组食管癌Eca109细胞增殖情况，测定方法同“1.2.2”项。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期情况：参考文献[9]并按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒中的要求进行操作，将四组食管癌Eca109细胞加入胰蛋白酶进行消化，加入FBS培养基终止消化，调整细胞密度为1×106个/ml并收集于1.5 ml EP管中，每管1 ml，用预冷PBS缓冲液清洗2次后离心，加入70%的乙醇溶液在4 ℃固定过夜，用PBS缓冲液清洗细胞后离心，重悬于PBS缓冲液中，加入2 μl RNA酶去除内源性RNA，加入1 μl Triton X-100增加细胞膜通透性，静置45 min后加入2 μl PI溶液，避光下染色1 h，用细胞流式仪观察并分析细胞凋亡及周期情况。每组5个复孔，实验重复3次(n=3)。

1.2.6 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力：收集四组食管癌Eca109细胞，调整细胞密度至2×105个/ml，各取细胞液200 μl加入预铺设稀释Matrigel胶的上室，用RPMI-1640培养液补至1 ml，下室加入含10% FBS的RPMI-1640培养液600 μl，培养24 h，擦拭胶上细胞及Matrigel胶，将小室于4%多聚甲醛中固定20 min并室温(25 ℃)风干，接着用结晶紫染液浸染20 min，室温风干后去除聚碳酸酯膜，置于载玻片上，以树胶封片，于光学显微镜下观察小室细胞侵袭情况，计算穿过Matrigel基质的平均细胞数[10]。实验重复3次(n=3)。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力：收集四组食管癌Eca109细胞，将细胞置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养，待细胞融合率约90%时，用200 μl枪头垂直于6孔板底部做横线划痕，之后继续置于恒温培养箱中培养12 h，于倒置显微镜下拍照观察，利用Image J软件测量划痕区域宽度，并计算细胞划痕愈合率(%)=[(0 h划痕区域宽度-12 h划痕区域宽度)/0 h划痕区域宽度]×100%[11]。实验重复3次(n=3)。

1.2.8 蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白、周期相关蛋白和MEK/ERK通路相关蛋白表达情况：收集四组食管癌Eca109细胞，吸去培养基后置于灭菌离心管中，加入RIPA裂解液提取其中蛋白质，用BCA蛋白试剂盒测定细胞中总蛋白含量，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质后转移至聚偏氟乙烯膜上，在4 ℃下添加Caspase-3、Bax、Bcl-2、cyclinD1、cyclinD3、CDK2、p-c-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK与β-actin一抗(均为1∶1 000稀释)孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤后添加二抗(1∶5 000稀释)常温下孵育2 h，采用凝胶成像仪对蛋白水平进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 胡黄连苷Ⅱ对食管癌Eca109细胞增殖的影响

与0 μmol/L组(0%)相比，5、10、20、40和60 μmol/L的胡黄连苷Ⅱ对食管癌Eca109细胞增殖抑制率[(14.06±1.69)%、(19.44±2.21)%、(25.71±2.59)%、(23.04±2.38)%和(21.25±2.25)%]显著升高(F=25.922，P=0.000)，其中20 μmol/L胡黄连苷Ⅱ对食管癌Eca109细胞增殖抑制率最高，因此，选择20 μmol/L胡黄连苷Ⅱ用于后续实验。

2.2 四组食管癌Eca109细胞增殖情况比较

与正常培养组[食管癌Eca109细胞增殖抑制率为(11.59±1.21)%]相比，胡黄连苷Ⅱ组食管癌Eca109细胞增殖抑制率[(25.68±1.68)%]升高，激活剂组细胞增殖抑制率[(8.01±1.20)%]降低；与胡黄连苷Ⅱ组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组食管癌Eca109细胞增殖抑制率[(15.30±1.27)%]降低；与激活剂组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组食管癌Eca109细胞增殖抑制率升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 四组食管癌Eca109细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达比较

与正常培养组相比，胡黄连苷Ⅱ组细胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低；激活剂组细胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。与胡黄连苷Ⅱ组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组细胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高；与激活剂组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组细胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1—2。

表1 四组食管癌Eca109细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达比较Tab 1 Comparison of apoptosis rate and expression of apoptosis-related protein among 4 group of esophageal

A.正常培养组；B.胡黄连苷Ⅱ组；C.激活剂组；D.胡黄连苷Ⅱ+激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图1 四组食管癌Eca109细胞凋亡率比较Fig 1 Comparison of apoptosis rate among 4 group of esophageal cancer Eca109 cells

A.正常培养组；B.胡黄连苷 Ⅱ 组；C.激活剂组；D.胡黄连苷 Ⅱ +激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图2 四组食管癌Eca109细胞凋亡相关蛋白表达比较Fig 2 Comparison of expression of apoptosis-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

2.4 四组食管癌Eca109细胞周期分布情况比较

与正常培养组相比，胡黄连苷Ⅱ组G0/G1期、S期比例升高，G2/M期比例降低；激活剂组G0/G1期、S期比例降低，G2/M期比例升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与胡黄连苷Ⅱ组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组G0/G1期、S期比例降低，G2/M期比例升高；与激活剂组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组G0/G1期、S期比例升高，G2/M期比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 四组食管癌Eca109细胞周期分布情况比较Tab 2 Comparison of distribution of cell cycle among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells n=3，%)

2.5 四组食管癌Eca109细胞侵袭及迁移能力比较

与正常培养组相比，胡黄连苷Ⅱ组侵袭细胞数、划痕愈合率降低，激活剂组侵袭细胞数、划痕愈合率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与胡黄连苷Ⅱ组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组侵袭细胞数、划痕愈合率升高；与激活剂组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组侵袭细胞数、划痕愈合率降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图3—4。

表3 四组食管癌Eca109细胞侵袭及迁移能力比较Tab 3 Comparison of invasive and metastasizing ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells n=3)

A.正常培养组；B.胡黄连苷Ⅱ组；C.激活剂组；D.胡黄连苷Ⅱ+激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图3 四组食管癌Eca109细胞侵袭能力比较(结晶紫染色，×200)Fig 3 Comparison of invasive ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells (crystal violet staining, ×200)

A.正常培养组；B.胡黄连苷Ⅱ组；C.激活剂组；D.胡黄连苷Ⅱ+激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图4 四组食管癌Eca109细胞迁移能力比较Fig 4 Comparison of metastasizing ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

2.6 四组食管癌Eca109细胞周期相关蛋白、MEK/ERK通路相关蛋白表达比较

与正常培养组相比，胡黄连苷Ⅱ组食管癌Eca109细胞周期相关蛋白(cyclinD1、cyclinD3和CDK2)、MEK/ERK通路相关蛋白(p-c-Raf、p-MEK和p-ERK)表达降低；激活剂组细胞周期相关蛋白、MEK/ERK通路相关蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与胡黄连苷Ⅱ组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组食管癌Eca109细胞周期相关蛋白、MEK/ERK通路相关蛋白表达升高；与激活剂组相比，胡黄连苷Ⅱ+激活剂组食管癌Eca109细胞周期相关蛋白、MEK/ERK通路相关蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图5—6。

表4 四组食管癌Eca109细胞周期及MEK/ERK通路相关蛋白表达比较Tab 4 Comparison of cell cycle and MEK/ERK pathway related protein expression of esophageal cancer Eca109 cells in each group n=3)

A.正常培养组；B.胡黄连苷 Ⅱ 组；C.激活剂组；D.胡黄连苷 Ⅱ +激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图5 四组食管癌Eca109细胞周期相关蛋白表达比较Fig 5 Comparison of expression of cell cycle-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

A.正常培养组；B.胡黄连苷Ⅱ组；C.激活剂组；D.胡黄连苷Ⅱ+激活剂组A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group图6 四组食管癌Eca109细胞MEK/ERK通路相关蛋白表达比较Fig 6 Comparison of expression MEK/ERK pathway-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

3 讨论

食管癌是常见的恶性肿瘤，我国是食管癌高发区，食管癌的发病与吸烟、喝酒及不良饮食习惯等多种因素密切相关，常有手术、化疗和放疗等多种治疗方法，但仍表现出较低的存活率[12]。因此，寻找有效的药物对于治疗食管癌具有重要意义。资料显示，胡黄连苷Ⅱ是中药胡黄连的有效成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗肿瘤、神经保护、护肝和抗胆固醇等多种药理作用[13]，可在缓解急性胰腺炎[14]、心肌梗死[15]等方面发挥重要作用；且胡黄连苷Ⅱ具有诱导肾癌细胞凋亡的作用，通过改变Bax、Bcl-2等细胞凋亡相关蛋白的表达来发挥作用[16]。Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡密切相关，Caspase-3、Bax是介导细胞凋亡的关键水解酶，是细胞凋亡过程中的重要调控因子；Bcl-2是一种抗凋亡因子，可侧面反应细胞凋亡状态[17]。本研究结果显示，与正常培养组相比，胡黄连苷Ⅱ组食管癌Eca109细胞增殖抑制率、凋亡率升高，Caspase-3、Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，细胞侵袭、迁移能力降低，表明胡黄连苷Ⅱ具有一定的诱导人食管癌Eca109细胞凋亡、抑制细胞侵袭、迁移的作用，推测其具有潜在的食管癌治疗作用，但其作用机制尚不明确。

细胞周期是由细胞周期蛋白(cyclins)及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)调控的，CDK4是CDK家族重要成员，在细胞周期调控过程中起到关键作用，当细胞受到不良刺激时，CDK4与cyclins D1结合形成复合物，进而引起细胞周期发生紊乱，使细胞分化减弱、异常增殖、功能紊乱，最后发展为肿瘤细胞[18]。MEK/ERK信号通路的过度激活与肿瘤的发生发展联系密切，ERK信号通路在血管内皮细胞增殖及新血管生成过程中发挥重要作用，持续性激活的ERK信号通路可正向调控细胞周期，推动细胞由G1期进入S期，进而促进细胞异常增殖与分化[19]。资料显示，活化的cyclins D可激活MEK/ERK信号通路，使得p-ERK表达增加，导致cyclins D等细胞周期相关蛋白的表达增加，加速细胞周期进程，促进细胞增殖，进而导致肿瘤的发生与发展[20]。本研究结果显示，胡黄连苷Ⅱ处理过的食管癌Eca109细胞周期相关蛋白、MEK/ERK通路相关蛋白表达较正常培养细胞降低，表明胡黄连苷Ⅱ具有一定的调节细胞周期并抑制MEK/ERK通路激活的作用；用胡黄连苷Ⅱ和MEK/ERK通路激活剂共同处理食管癌Eca109细胞后，药物的抑制增殖及抗凋亡能力减弱，进一步表明胡黄连苷Ⅱ抑制MEK/ERK通路是其发挥抗食管癌作用的重要机制之一。

综上所述，胡黄连苷Ⅱ具有抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，与调节细胞凋亡、周期相关蛋白的表达密切相关，其中抑制MEK/ERK通路在抗食管癌细胞增殖过程中起到重要作用，但其作用机制较为复杂，仍需深入研究。