基于网络药理学和分子对接技术探讨小儿清热化积散治疗小儿急热惊风的作用机制研究Δ

伍 超，黄志鸿，陆 珊，刘鑫馗，范啸天，谭影影，巫志姗，李佳霖，张晓朦，王苗苗，吴嘉瑞

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

小儿急热惊风为中医儿科常见急危症，多由外感时邪、湿热内蕴、痰蒙热闭及热极生风等病因引起，以高热、四肢抽搐、牙关紧闭和意识障碍等为主要临床表现。若治疗不及时，可严重影响患儿脑部及身体生长发育，甚至诱发癫痫等疾病，给患儿及其家庭的未来生活造成巨大的物质及身心负担[1-2]。中医临床治疗小儿急热惊风，以清热豁痰、开窍醒神、息风镇惊和补益和中为原则[3-4]。小儿清热化积散由川贝母、大黄、全蝎、琥珀、僵蚕(麸炒)、牛黄、冰片、天麻、黄连、胆南星及甘草等11味中药组成，具有化积、镇惊息风和清热豁痰的功效，契合治疗原则，临床上常用于治疗小儿急热惊风、四肢抽搐、痰雍盛以及发热咳嗽。但是，尚无小儿清热化积散相关的药理作用机制报道。中药及其复方均存在活性成分复杂、作用靶点及途径多样的现象，常规单一靶标研究方法较难全面阐释中药及其复方的药理作用机制。网络药理学整合系统生物学、生物信息学及计算机科学等多学科技术方法，构建并分析生物分子网络，其研究方法具有高通量、整体性的特点，已被广泛应用于中药及中药复方的活性成分预测及作用机制研究[5-6]。本研究拟采用网络药理学的技术方法，整体性研究小儿清热化积散治疗小儿急热惊风的作用机制，并利用分子对接技术核查重要化合物与关键靶点的结合能力，以期为小儿清热化积散的基础研究及临床合理应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 小儿清热化积散活性化合物的收集

将小儿清热化积散中11味中药分别进行数据库检索和文献阅读，以获得相关活性化合物。检索中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/index.php)，检索限制条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、肠道吸收Caco-2≥-0.4和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18；检索中药系统药理学成分分析平台(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm)，检索限制条件为Score cutoff≤20、P<0.05；检索中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://119.3.41.228∶8000/tcmid)。上述数据库缺失的中药化合物信息通过阅读文献找回。除TCMSP数据库获得的化合物外，其余途径获得的化合物均通过瑞士洛桑大学生物信息学研究所Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch)进行药物吸收度和DL的筛选。

1.2 潜在生物靶点数据的收集

1.2.1 小儿清热化积散潜在靶点的预测：通过瑞士洛桑大学生物信息学研究所Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，对“1.1”项下所有潜在活性化合物进行作用靶点预测，取可能性(probability)>0.1的靶点。对于TCMSP、BATMAN-TCM数据库中化合物对应的靶点经蛋白质数据库Uniprot(https://www.uniprot.org)，选择物种“智人(Homosapiens)”，进行名称校正，再合并收集上述所有靶点作为小儿清热化积散的预测靶点。

1.2.2 小儿急热惊风相关疾病靶点的收集：现代医学中惊厥、热性惊厥和癫痫等疾病均属于小儿急热惊风范畴。故分别以“convulsion”“infantile convulsion”“febrile convulsions”和“infantile epilepsy”为关键词，检索疾病靶点DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)及治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(https://db.idrblab.org/ttd)，获得惊厥、热性惊厥、小儿惊厥及小儿癫痫等小儿急热惊风相关疾病的靶点。

1.3 生物网络的构建与分析

STRING数据库(https://string-db.org/)提供可以直观反映蛋白质之间相互作用和预测作用的信息[7]。将上述收集的所有靶点信息上传至STRING数据库，选择物种“智人(Homosapiens)”，获得相关蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)数据。运用Cytoscape 3.6.1软件对PPI数据进行可视化处理，并通过网络拓扑参数度值(degree)、紧密中心性(closeness-centrality)分析网络中的靶点。使用Cytoscape软件中的MCODE功能对PPI网络进行模块化处理，选取评分>10分的模块作为重要模块进行分析。

1.4 关键靶点生物信息学分析

提取小儿清热化积散与小儿急热惊风网络中的交集子网络，将子网络中的度值为平均值以上的靶点作为重要靶点。再把重要靶点与重要模块中的靶点的交集作为关键靶点。借助R软件包中的clusterProfiler包对上述靶点进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，限定分析条件为“Pvalue Cutoff=0.05，Qvalue Cutoff=0.05”。

1.5 分子对接验证

分子对接技术可以评价潜在靶点与其相关联化合物的结合能力[8]。采用AutoDock 4.2和AutoDock Vina软件对关键靶点与其相关联化合物进行分子对接模拟。大分子蛋白靶受体从结构生物信息学研究合作组织(research collaboration for structural bioinformatics，RCSB)蛋白质结构数据库(protein data bank，PDB)(https：//www.rcsb.org)获得；小分子化合物组分的二维结构从PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得。密切系数越低(结合能<0 kcal/mol)则认为化合物与生物分子靶点之间越能自发结合[9]。

2 结果

2.1 小儿清热化积散活性化合物及其预测靶点网络

通过TCMSP、BATMAN-TCM和TCMID数据库和相关文献报道[10-13]，收集到活性化合物：牛黄15个，冰片18个，全蝎7个，僵蚕15个，天麻13个，川贝母8个，胆南星4个，大黄8个，黄连13个，琥珀10个，甘草16个。整理去重后，共有122个潜在活性化合物。为清楚展示活性化合物与预测靶点之间的关系，选取度值排序居前20位的活性化合物，结合其预测的作用靶点构建“化合物-靶点”网络，见图1。该网络由682个节点、1 976条边组成，节点越大表示度值越高，说明该节点越重要。

图1 “化合物-靶点”网络关系图Fig 1 Relation diagram of “compound-target” network

2.2 小儿急热惊风相关疾病靶点分析

从DisGeNET、GeneCards和TTD数据库中共收集得到小儿急热惊风疾病相关靶点1 023个。经R软件clusterProfiler包对疾病靶点进行GO和KEGG分析发现，小儿急热惊风与膜电位调节、对金属离子的反应、氧化应激反应、化学突触传递的调节、跨突触信号的调节以及神经元死亡等生物过程相关；与神经元细胞体、转运体复合体、跨膜转运蛋白复合物、离子通道复合体以及突触前膜等细胞组成相关；涉及PI3K-AKT、阿尔茨海默病、神经活性配体-受体相互作用、MAPK、人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Ras、cAMP、人类免疫缺陷病毒1型感染以及恶性肿瘤中的蛋白多糖等信号通路，见图2。提示对于小儿急热惊风的治疗很可能与神经元膜电位调节、神经调节等生物功能相关。

图2 疾病靶点GO和KEGG分析图Fig 2 Diagram of GO and KEGG analysis on disease targets

2.3 “化合物-靶点-疾病”网络与重要靶点分析

通过STRING数据库获得化合物预测靶点与疾病靶点的PPI网络数据信息，利用Cytoscape软件中Merge功能合并“化合物-靶点”和“疾病-靶点”网络，得到“化合物-靶点-疾病”网络。从该网络中获得304个“化合物-靶点”和“疾病-靶点”网络共有靶点，见图3(A)。将共有靶点视作小儿清热化积散对小儿急热惊风的疗效潜在作用靶点。经拓扑网络参数分析，取度值>39.366、紧密中心性>0.487的83个靶点为重要靶点，见图3(B)。通过R软件clusterProfiler包对疗效潜在作用靶点进行GO和KEGG富集分析，结果显示，上述靶点的生物过程包括膜电位调节、对抗菌药物的反应、化学突触传递的调节、跨突触信号的调节、膜去极化以及离子跨膜转运的调控等；细胞组成包括离子通道复合体、跨膜转运蛋白复合物、转运体复合体以及神经元细胞体等；分子功能包括门控通道活动、离子通道活性、被动跨膜转运蛋白活性以及阳离子通道活性等；涉及神经活性配体-受体相互作用、阿尔茨海默病、MAPK、Ras、恶性肿瘤中的蛋白多糖以及cAMP等信号通路，见图3(C)。

A.“化合物-靶点”与“疾病-靶点”网络交集韦恩图；B.重要靶点网络图；C.重要靶点GO与KEGG分析A.Venn diagram of the intersection of “compound-target” and “disease-target” networks；B.important targets network；C. Go and KEGG analysis of important targets图3 “化合物-疾病-靶点”网络相关分析Fig 3 Correlation analysis on “compound-disease-target”network

2.4 网络模块和关键靶点分析

从网络模块分析中获得的聚类模块可能代表PPI网络的一些关键特征，并且可能具有特定的生物学意义。使用Cytoscape软件中的MCODE插件对PPI网络中的目标进行模块分析，结果显示，有2个模块的MCODE评分>10分，模块1为41.375分[见图4(A)]，模块2为10.080分[见图4(B)]；分别对2个模块进行生物学注释，发现模块2所涉及的生物功能与小儿急热惊风病理表现相关，见图4(C)。通过R软件clusterProfiler包对模块2的靶点进行GO和KEGG富集分析，归纳总结小儿清热化积散治疗小儿急热惊风的重要作用机制与神经活性配体-受体相互作用、cAMP、cGMP-PKG以及Rap1等信号通路相关，见图5。其中，15个靶点源自潜在疗效作用靶点，将其与83个重要靶点取交集，即得到5个关键靶点DRD2、HTR1A、OPRK1、GABBR2及PIK3CA。

A.模块1靶点网络图；B.模块2靶点网络图；C.模块2靶点GO和KEGG分析A.module 1 network；B.module 2 network；C.Go and KEGG analysis in module 2图4 网络模块分析Fig 4 Network module analysis

图5 “通路-效应”示意图Fig 5 Interpretation of “pathway-effect”

2.5 分子对接分析

将上述关键靶点与其对应的化合物进行分子对接模拟，以Affinity等参数展示结果，见表1。由于HTR1A没有足够解析度的晶体结构，故本研究只对DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA等4个靶点进行分子对接验证。一般认为，结合能<0 kcal/mol是配体与受体之间有自发结合的可能，结合能<-5 kcal/mol指配体与受体之间有很好的自发结合能力。选取关键靶点与化合物最优结合构象(结合能最低)，借助PyMol软件对其可视化，见图6。

图6 关键靶点分子对接最优构象Fig 6 Optimal conformation of molecular docking of key target

表1 分子对接结果Tab 1 Result of molecular docking

3 讨论

本研究发现，小儿急热惊风相关疾病靶点的生物学功能与膜电位调节、氧化应激反应、化学突触传递的调节、跨突触信号的调节、对抗菌药物的反应、神经元死亡的调控、门控通道活动、被动跨膜转运蛋白活性、电压门控离子通道活性以及离子通道活性等密切相关。这些靶点涉及的神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt、cAMP、cGMP-PKG、MAPK、人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染以及Rap1等信号通路可形成通路串话而介导机体发热、神经系统异常兴奋、神经元凋亡、钙离子失调及平滑肌收缩等效应[14-17]。其中，高富集指数的神经活性配体-受体相互作用、cAMP、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1及MAPK等6条信号通路的紊乱已被报道可引发炎症因子增多、异常发热、神经系统高兴奋性和惊厥抽搐等现象[18-21]，甚至与帕金森病、抑郁症及胶质母细胞瘤的发病相关[22-24]。因此，针对性干预上述6条信号通路可能是较优的治疗策略。

小儿清热化积散功专小儿急惊、痰热蒙蔽，效以开窍定惊、清热豁痰，且其“化合物-靶点-疾病”生物网络中的疗效潜在作用靶点均显著富集于神经活性配体-受体相互作用、cAMP、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1及MAPK等6条信号通路(见图5)，从而肯定了小儿清热化积散在退热、镇静、抗惊厥和抗炎等方面的疗效。再者，通过分子对接技术进一步验证4个关键靶点(DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA)。多巴胺受体D2(DRD2)是多巴胺G蛋白偶联受体中的D2亚型，其活性由抑制腺苷酸环化酶的G蛋白介导。研究结果表明，DRD2是调控睡眠-觉醒活动的重要受体，与神经系统兴奋性密切相关[25]。DRD2可以通过调节下游抗炎蛋白α-crystallin维持中枢神经系统免疫内环境稳态，调节下游β-arrestins蛋白发挥神经保护作用。此外，DRD2还与实验动物出现惊吓反应相关[26]。κ型阿片受体(OPRK1)通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)触发信号，并调节下游效应物(如腺苷酸环化酶)的活性，发挥镇静、镇痛等作用。OPRK1还可通过减少钙离子电流和增加钾离子电导来抑制神经递质的释放；作用于多巴胺转运蛋白，阻断多巴胺的突触前摄取，使累赘巴胺信号传递至突出后神经元[27]。γ-氨基丁酸B型受体亚单位2(GABBR2)主要在脑组织表达，编码中枢神经系统主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸的代谢型受体组成部分的GABAB2亚基。据报道，GABBR2基因突变与重度抑郁症、自闭症和癫痫性脑病等多种神经类疾病相关[28]。磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α亚型(PIK3CA)编码PI3K/AKT信号转导通路中Ⅰ类磷脂酰肌醇3激酶(PI3Ks)的p110催化亚单位PI3Kp110α。PIK3CA及PI3K/AKT信号通路的过度激活是儿童局灶性顽固性癫痫、局灶性脑皮质异常发育的常见原因[29-30]。由此可见，DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA等靶点介导的生物功能确切与小儿急热惊风发病和小儿清热化积散的疗效相关。

综上所述，小儿清热化积散可能通过神经活性配体-受体相互作用、cAMP、cGMP-PKG及Rap1等信号通路网络调控下丘脑体温调节中枢、神经元兴奋性、平滑肌活动性、细胞凋亡和细胞生存以及增殖等功能治疗小儿急热惊风，DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA可能是其关键作用靶点。