清热消积方通过PD-1/PD-L1途径调控荷Lewis肺癌移植瘤小鼠免疫功能的实验研究*

张庆乾 叶 菁 陈 淼 陈嘉斌 徐国暑 谢鑫灵 余志红

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

清热消积方基于肿瘤患者“正气虚损、阴阳失衡、脏腑功能失调，痰、瘀、热、毒互结”的病机而组方。已有研究证实该复方具有较好的抗肿瘤效果，但其是否通过调控免疫功能进而发挥抗肿瘤作用尚不清楚。本研究采用荷瘤Lewis肺癌小鼠移植瘤作为研究对象，观察其对肿瘤组织PD-1/PD-L1 蛋白及相关细胞因子的影响，对其抗肿瘤机理进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 动物模型：Lewis肺癌细胞株购于中国科学院典型培养物保藏中心（中国科学院上海生命科学院细胞库）。1.1.2 实验用药：清热消积方中药材蛇六谷、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝等由浙江省立同德医院药房提供。以上药材采用粉碎机进行粉碎，过200 目药筛后于3～5L圆底烧瓶中，加水混匀后置于中药陶瓷罐中加热提取2h，过滤收集全部滤液。残渣重复提取，合并两次滤液，于旋转蒸发仪中减压浓缩。最后将全部中药提取后浓缩提取液，并于冷冻干燥机中低温减压干燥，备用。

1.1.3 主要试剂及仪器：小鼠血清γ 干扰素（IFN-γ）试剂盒、白介素-2（IL-2）试剂盒以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DMEM细胞培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶消化液均购自兰堡生物技术服务部；小鼠脱毛剂（LANUOR 兰诺儿）购于杭州宏莱生物科技有限公司。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 细胞培养：在25cm2细胞培养瓶中，含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培养液培养肺癌细胞株Lewis，置于5% CO2培养箱，待生长至80%融合时用0.25%胰酶-EDTA消化传代。待细胞量足够实验使用时，传代到6孔板中，传代时细胞浓度约为2×105个。

1.2.2 荷瘤小鼠模型制备：选取40 只SPF 级C57BL/6J雄性小鼠在实验动物中心适应性饲养1周后，分别于小鼠右腋窝皮下注射Lewis 肺癌细胞0.1ml，细胞悬液肿瘤细胞数为1×107/ml，全程无菌操作，规定在30min 内注射完成，制备荷瘤小鼠。

1.2.3 实验分组：将接种后的荷瘤小鼠随机分为4组，其中中药组给予清热消积方药液0.2ml/10g量，灌胃给药，每日2 次，连续给药3 周；安慰剂组给予同等剂量的生理盐水灌胃；阳性对照组给予顺铂，腹腔注射，1 次10mg/kg，每周1 次，连续给药3 周；模型组自由饮水。停药次日，取荷瘤小鼠眼球外周血后处死，剥离皮下瘤体，留取瘤体新鲜组织待用。

1.2.4 ELISA 法检测IFN-γ、IL-2 和TNF-α 的水平：将采集的血液离心后收集血清，严格按照IFN-γ、IL-2和TNF-α 试剂盒说明书操作，于酶标仪上检测血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平。

1.2.5 流式细胞仪检测CD8+PD-1+T 细胞和CD8+PD-1-T细胞：使用眼科剪将肿瘤组织剪碎，PBS 漂洗后加入0.25%胰蛋白酶液制成浓度约为1.5×107个/ml 的单细胞悬液，然后采用磁珠分选仪进行CD8+T细胞分选，CD8-APC 抗体单染后，加入流式分选仪进行流式分析，获得CD8+标记的T细胞后，经离心和重悬后，加入PD-1-PE抗体单染，经流式分选仪分析后获得CD8+/PD-1+的T细胞。

1.2.6 免疫组化法检测PD-L1的表达：肿瘤组织经10%福尔马林固定后，常规石蜡包埋并制成4μm厚的切片，然后采用丹麦DAKO公司EnVisionTM二步法进行了免疫组化染色检测。使用二甲苯对石蜡切片水化，抗原修复后滴加一抗，孵育完毕后滴加二抗，室温孵育后滴加预备好的显色剂DAB，室温孵育后用蒸馏水冲洗终止显色，苏木精复染后封片。

1.2.7 免疫组化染色结果判定：PD-L1 阳性细胞随机选取5个高倍镜视野（×40）进行细胞计数，评分方法根据Remmele 和Stegner 提出的免疫反应积分（IRS）评分法[1]，即染色强度（SI）和阳性细胞百分比（PP）的乘积，IRS=SI×PP，当SI与PP的乘积＞3分时为阳性。

1.3 统计分析方法：采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立肺癌移植瘤模型：C57BL/6J 小鼠接种Lewis

肺癌细胞悬液1周后可在右腋皮下触及米粒大小结节，连续观察10天左右，小鼠接种部位皮下肿块持续存在，无自然消退现象，成瘤率达100%，说明建模成功，符合实验要求。

2.2 各组血清IFN-γ、IL-2和TNF-α水平：见表1。

表1 各组小鼠血清细胞因子水平变化（±s，pg/ml)

表1 各组小鼠血清细胞因子水平变化（±s，pg/ml)

注：与安慰剂组及模型组比较，aP＜0.05。

组别安慰剂组模型组阳性对照组中药组TNF-α 45.49±6.45 56.21±7.07 26.41±4.48a 31.55±6.53a INF-γ 522.38±40.47 533.52±36.71 638.95±68.38a 609.99±48.13a IL-2 18.55±2.27 21.33±2.42 29.33±2.28a 25.52±3.05a

2.3 对肿瘤组织CD8+PD-1+T 细胞和CD8+PD-1-T 细胞表达的影响：与中药组和阳性对照组相比，安慰剂组及模型组肿瘤组织中CD8+PD-1+T细胞比例明显降低，CD8+PD-1-T细胞比例明显增高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组CD8+PD-1+T细胞和CD8+PD-1-T细胞水平

2.4 对肿瘤组织PD-L1表达的影响：安慰剂组及模型组肿瘤组织PD-L1的阳性染色细胞明显高于中药组及阳性对照组（P＜0.05），见图2A；安慰剂组和模型组IRS评分明显高于中药组及阳性对照组（P＜0.05），见图2B。

图2 各组肿瘤组织PD-L1免疫组化染色结果（×40）

3 讨论

清热消积方由蛇六谷、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、白豆蔻等组成，具有清热解毒、化痰散结、理气行瘀等功效。前期研究显示，清热消积方能够抗肿瘤血管形成[2]。本研究结果显示，清热消积方能够提高IFN-γ、IL-2水平，降低TNF-α水平。TNF-α在肿瘤微环境中起重要作用，肿瘤细胞自分泌的或髓样细胞旁分泌的TNF-α 通过诱导活性氧和活性氮的产生，对肿瘤细胞DNA 造成损伤，从而诱导肿瘤细胞的突变，从而促进肿瘤细胞发生及上皮间质转化（EMT）[3]。IL-2 可以刺激CD8+T细胞的活化为毒性T淋巴细胞，并激活NK细胞，促使其分泌干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞[4]。进一步通过流式细胞仪检测T 细胞表型发现，清热消积方能够提高肿瘤组织中PD-1 耗竭的CD8+T细胞的PD-1表达，其作用效果同阳性对照药顺铂相似，说明清热消积方可能通过提高PD-1 的表达，促进CD8+T细胞，即毒性T淋巴细胞的活化，促进IFN-γ、IL-2因子分泌，抑制TNF-α 分泌，从而达到抑瘤效应。目前研究发现，阻断PD-1/PD-L1途径可显著提高特异性T细胞对肿瘤的杀伤效果[5]。本研究中进一步通过免疫组化法检测了肿瘤组织中PD-L1蛋白表达，结果提示清热消积方给药后，肿瘤组织中PD-L1蛋白表达明显降低，其IRS评分明显高于安慰剂组及模型组，但与阳性对照药顺铂相似，提示清热消积方可能通过降低PD-L1表达调控肿瘤小鼠的免疫功能。综上，清热消积方能够提高血清IFNγ、IL-2 含量，降低TNF-α 水平，其作用机制可能与降低PD-L1表达进而激活T细胞有关。