金银花枝叶提取液体外抑菌活性与体内抗炎作用研究

吕归红 陈 宇

1 杭州市富阳中医骨伤医院 浙江 杭州 311400

2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

金银花首载于梁·陶弘景《名医别录》，名忍冬，为常用中药［1］，其味甘，性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、凉散风热之功效［2］。现代药理研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗炎、解热、增强免疫、降血脂、抗内毒素、利胆、保肝、抗肿瘤等药理作用［3］。大量研究显示，金银花具有广谱抗菌作用[4]，可抑制金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、大肠杆菌等多种细菌，被称为抗菌之王[5]。金银花的副产物枝叶产量较高，却一直被视为非药用部位而长期未得到利用。《本草纲目》：“茎叶及花，功用皆同。”现代药理研究也表明金银花枝叶与金银花具有相近的化学成分和药理活性。随着抗生素的广泛使用以及微生物耐药现象越趋严重，对于寻找、合理开发、使用中草药替代西药解决抗菌消炎问题和防止二次污染的研究具有非常重要的意义。本实验通过金银花枝叶提取液的体外抑菌和体内抗炎作用研究，探讨其体外抑菌效果和对急性炎症作用的影响，为金银花枝叶的合理开发利用提供实验基础，有利于进一步开发绿色环保的抗菌中草药。

1 材料

1.1 动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。

1.2 仪器：二氧化碳培养箱（日本THERRMO）；SW-CJ 型生物洁净工作台（苏州净化）；全自动手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）；METTLER AE-240 电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；J-15R 冷冻型高效台式离心机[贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司]。

1.3 试药：金黄色葡萄球菌(ATCC23259)、大肠埃希菌(ATCC22953)、铜绿假单胞菌(ATCC23578)由浙江省临床检验中心提供；金银花枝叶提取液由浙江省中医药研究院中药研究中心提供，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 金银花枝叶提取液制备：准确称取金银花枝叶100g，加入14倍量70%浓度乙醇溶液，分2次提取，每次1.5h，制备得到提取液，过滤，回收乙醇，水浴上浓缩至100ml，制成1mg/ml 的溶液，灭菌，密封，4℃冰箱保存备用。

2.2 供试菌株和含菌平板制备：无菌条件下，将供试菌种移接入相对应的培养基上，35～37℃恒温箱内培养44～48h，0～4℃下冷藏备用。分别用接种环取少许菌体置于装有9ml 无菌生理盐水试管内，振荡摇匀，制成菌悬液，含菌体量103～105 个/ml，分别用无菌移液管向相应的固体平板上加0.1ml 菌悬液，并涂布均匀。

2.3 抑菌圈直径测定：采用药敏纸片法将6mm 定性滤纸小圆片分装于洁净干燥试管内，120℃干热灭菌2h后备用。无菌操作下将100 片灭菌滤纸片浸于1ml 各浓度金银花枝叶醇提物中，置冰箱内浸泡1h，然后置于37℃电热恒温培养箱内干燥2～3h 后无菌操作贴在制备好的含菌平板上，以相同浓度滤纸片3片作为1片，每皿均匀分贴不同药液滤纸片10 片，重复3 次；置于恒温培养箱中培养18～24h后取出观察，以药敏纸片周围无色区域为抑菌圈，测量直径，求出3个平皿的平均值。金银花枝叶提取液对三种病原菌均有抑制作用，金黄色葡萄球菌较强敏感性，大肠埃希菌中度敏感，铜绿假单胞菌低度敏感，结果见表1。

表1 对三种细菌的抑菌结果（±s，mm)

表1 对三种细菌的抑菌结果（±s，mm)

抑菌圈直径20.68±0.35 15.98±0.16 11.67±0.18菌 株金黄色葡萄球菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌空白对照－－－

2.4 最低抑菌浓度（MIC）测定：采用试管二倍稀释法，13mm×100mm灭菌具塞试管11支。每管先加入无菌肉汤培养基2ml，然后于第1 管中加入灭菌金银花提取物2ml，混匀后取出2ml 放入第2 管中，依次类推，直到第9管取出2ml 弃去，配成含中药提取物分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……各浓度液体。第10管不加药物作为对照，以观察培养基是否适合细菌生长。第11 管加受试药液2ml，混匀取出2ml 弃去，不加细菌，以观察受试中药是否污染。将培养6h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌试验菌液用无菌肉汤稀释，取0.1ml分别加入1～10管中，混匀后一起放入37℃培养箱中培养18h。记录各管内细菌生长情况，以浑浊度为指标检查有无细菌生长，以不显示浑浊、细菌未生长的药液稀释度为MIC。金银花枝叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌MIC值为0.0308g/ml，而对铜绿假单胞菌为0.128g/ml，说明金银花枝叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌有较好的抑菌作用，对铜绿假单胞菌有较低的抑制作用，并随着浓度的增大抑菌效果增强。结果见表2。

表2 对各种细菌的最小抑菌浓度（MIC）

2.5 金银花枝叶提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响：取ICR 小鼠40 只，随机分成4 组（空白对照组、模型组、阳性对照组、金银花枝叶提取液组），每组10 只。灌胃：空白对照组0.9%生理盐水20ml/kg，阳性药物组吲哚美辛10mg/kg，金银花枝叶提取液组1mg/ml 提取液20ml/kg。给药7 天，末次给药40min 后，除空白组外按20μl/只均匀涂抹二甲苯于右耳正反两面，20min 后脱颈处死，用直径9mm 打孔器在左右耳同一部位冲下耳片，分别称定重量，计算耳肿胀及耳肿胀抑制率，结果见表3。

表3 对小鼠耳肿胀的影响（±s）

表3 对小鼠耳肿胀的影响（±s）

注：与模型组比较，bP＜0.05。

组别空白对照组模型组阳性对照组金银花枝叶提取液组耳肿胀度1.12±0.58 13.43±3.44 7.11±2.89b 9.40±2.71b抑制率——47.06%30.01%

2.6 金银花枝叶提取液对白细胞（WBC）数、血红蛋白（Hb）的影响：按“2.5”项下方法构建急性炎症小鼠模型，30min 后，摘眼球取血，采集的血液按照血常规方法测定血液中白细胞（WBC）数、血红蛋白（Hb）的含量，结果见表4。

表4 对急性炎症小鼠WBC、Hb的影响（±s）

表4 对急性炎症小鼠WBC、Hb的影响（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

组别空白对照组模型组阳性对照组金银花枝叶提取液组Hb（g·L-1）142.26±4.49 111.64±5.41a 134.58±8.92b 128.33±7.42b WBC（×109·L-1）6.27±0.76 8.52±0.49a 5.84±0.69b 7.65±0.63b

3 小结

血液中的白细胞、血红蛋白水平在一定程度上可以反映骨髓的造血功能，炎症发生时白细胞升高、而Hb水平会有不同程度降低。本实验结果显示，急性炎症小鼠造模成功后白细胞升高，Hb 有一定程度下降，符合预期，而当给予了金银花枝叶提取液的炎症小鼠，其白细胞水平降低，同时Hb得到显著回升；通过急性炎症实验表明金银花枝叶提取液又能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，由此可见金银花枝叶提取液对急性炎症有一定的治疗作用。