基于网络药理学的如意金黄散治疗疖肿的机制研究

张涛 ，周春宇 ，杨成城 ，张少辉 ，门斯烨 ，钱嘉惠 ，马亦湘 ，安佳琳

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

疖肿（Furuncle）是人体皮肤单个毛囊或皮脂腺发生的急性化脓性感染，常由皮肤扩展到皮下组织，是常见的皮肤科外科疾病。致病菌多为金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌。疖肿易发生于毛囊和皮脂腺丰富的部位如头面、颈、背等部位。多个疖连成一片形成痈。表现为局部红肿热痛。西医治疗多以静脉应用抗生素，局部切开引流排脓为主[1]。中医药在疖肿的治疗上能够清热解毒，散结消肿，并且在改善症状方面有独特优势，效果显著。如意金黄散出自明代陈实功《外科正宗》[2]，收录于2015版《中国药典》[3]。全方中大黄、黄柏苦寒解毒为君药。陈皮、天南星、苍术、厚朴燥湿化痰行气，姜黄破血行气共为臣药。天花粉、白芷清热解毒，消肿止痛为佐药。甘草调和诸药，兼以甘缓敛疮为使药。诸药合用，使得热毒得除，瘀血得散，气滞得行，疖肿可消。如意金黄散被广泛应用于疖肿的临床治疗且效果显著。故笔者基于网络药理学从成分-靶点-通路预测如意金黄散治疗疖肿的作用机制。

1 材料与方法

1.1 复方化学成分收集及药物靶点预测 将大黄、黄柏、陈皮、天南星、苍术、厚朴、姜黄、天花粉、白芷、甘草输入中药系统药理学数据库Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database[4]（TCMSPTM，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）。筛选条件：口服生物利用度（OB）≥30%、类药性指数（DL）≥0.18[5]。药物靶点数据来源于Drugbank[6]（https：//www.drugbank.ca/），应用 Uniprot（https：//www.Uniprot.org/）数据库使其标准化。

1.2 疾病靶点来源 基于GeneCards（https：//www.genecards.org/） 与 OMIM-NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）数据库以疖肿、Furuncle为关键词筛选疾病靶点。

1.3 复方-疾病交集基因的获取 应用R软件中的Draw Venn Diagrams工具对1.1与1.2中获取到的药物靶点与疾病靶点进行处理，获得交集基因靶点。

1.4 如意金黄散治疗疖肿的靶蛋白相互作用（Protein protein interaction，PPI）网络构建 将如意金黄散的活性化学成分，核心靶标通过STRING数据库与Cytoscape 3.7.1进行PPI蛋白网络互作分析，构建药物-活性化学成分-核心靶标网络。

1.5 GO功能富集和KEGG通路分析 基于Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）中的R包（https：//www.r-project.org/）clusterprofile version 3.12.0对核心靶标进行基因本体论（Gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书通路分析（KEGG pathway analysis）。选择物种为人（Homo spanies），设定阈值P<0.05，根据结果在Cytoscape3.7.1进行核心靶标-关键通路网络。

2 结果

2.1 复方化学成分及药物靶点 本次研究共收集如意金黄散药物化学成分126个，预测靶点279个，如意金黄散各中药有效成分见表1。

表1 如意金黄散的有效成分

2.2 疾病靶点的获取 在GeneCards与OMIMNCBI数据库中以“Furuncle、Scabies”为关键词进行检索，GeneCards数据库按照Relevance score≥10筛选，将2个数据库中所得的疾病靶点汇总并删除重复，共获得165个，将其作为候选靶标来源。

2.3 获取交集基因及网络构建

2.3.1 获取复方-疾病交集基因 将1.1与1.2中获得的复方药物靶点与疾病靶点数据导入到R软件，应用Draw Venn Diagrams工具获取交集基因，见表2；并绘制韦恩图，见图1。

表2 如意金黄散治疗疖肿的20个靶蛋白

续表

续表

图1 复方-疾病交集基因韦恩图

2.3.2 构建成分-靶点网络图 运用Cytoscape3.7.1中Network Analyze插件构建复方化学成分-靶点作用网络，见图2。网络共有76个节点，93条边。方形代表核心靶标，椭圆形代表活性化学成分，不同颜色代表来自不同药物。每条边代表化合物与靶点的关系。通过分析排名前5的化学成分是槲皮素、汉黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、Formononetin和芒柄花素；靶点排名前5的是前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、白细胞介素（IL）-6、IL-4和表皮生长因子受体（EGFR）；一个化学成分往往与多个交集基因靶点对应，且一个交集基因与靶点也同时对应多个化学成分，化学成分又从属于不同的中药，这说明如意金黄散治疗疖肿是通过多成分、多靶点、多通路起效的，见图2。

图2 复方化学成分-靶点作用网络

2.4 交集基因PPI网络构建与分析 应用STRING数据库对交集基因导初步构建蛋白作用网络，见图3。网络图包括20个节点，138条边。节点代表蛋白，边代表蛋白与蛋白之间的作用关系。网络连接程度越高说明蛋白之间关系越密切。通过观察IL-6、IL-4、EGFR在网络中连接程度较高，说明这3个靶蛋白是网络中的关键靶点。

图3 如意金黄散与疖肿蛋白质相互作用核心网络图

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析 基于Bioconductor中的R包对核心靶标进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。富集条件为pvalueCutoff=0.05且qvalueCutoff=0.05，其余默认原始设置，并根据每个项目的P值、Q值及富集在其上的基因数目绘制气泡图，见图4、5，横坐标表示靶点数，左边表示生物学过程，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。GO富集中交集基因主要参与了白细胞-细胞黏附、蛋白质定位建立的正调控、多细胞组织内稳态等生物学过程。KEGG通路主要涉及IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路以及肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等。

图4 交集基因GO分析图

图5 交集基因KEGG通路富集图

3 讨论

疖肿相当于中医上的疖。多因内郁湿火，外感风邪，蕴阻肌肤所致。根据其病因、证候的不同，可以分为有头疖、无头疖、疖病等。临床上多表现为局部皮肤的红肿热痛，并伴有发热、口渴、苔黄、便秘等症状[7]。如意金黄散是《外科正宗》的经典方剂，在治疗疖，痈，疔，疽，湿痰流毒，火丹等疾病疗效显著[8]。现代药理学研究显示，周聪和等[9]研究发现，如意金黄散能够抑制金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，并且可以明显降低炎性肉芽囊的质量，减少炎性渗出，控制炎症的发展。张远哲等[10]通过大鼠实验研究发现，如意金黄散能够有效调控TNF-α等炎性介质的表达和释放，从而达到消炎止痛的作用。王喜云等[11]研究发现，如意金黄散能够显著提高大鼠血清中的溶酶菌的含量。这说明如意金黄散能够整体治疗疮疡，并能够提高机体的防御能力。因此，如意金黄散被广泛用于疖肿的治疗。

本研究基于网络药理学的方法研究如意金黄散治疗疖肿的作用机制。根据OB和DL参数，共筛选出如意金黄散化学成分126个，预测靶点279个。结果表明，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是其主要的化学成分。药理学研究表明，槲皮素是一种黄酮类化合物，能够有效抑制TNF和IL等炎性因子的表达，且有舒张血管的作用，能够清除氧自由基，从而达到有抗炎，抗氧化，消炎镇痛的作用[12-14]。刘威良等[15]发现β-谷甾醇通过调节下丘脑-垂体-肾上腺激素系统达到类似激素样抗炎的作用。肖志彬等[16]发现β-谷甾醇可以增强血清中氧自由基清除能力，降低TNF水平达到抗炎的作用。田媛媛等[17]研究发现豆甾醇能够显著降低IL-6，IL-1B等炎性因子的表达，有明显的抗炎作用。在如意金黄散的主要化学成分中，槲皮素主要来源于黄柏。β-谷甾醇主要来源于黄柏、大黄和天南星。豆甾醇主要来源于黄柏、姜黄和天南星。这说明如意金黄散可能是通过多味中药中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等主要化学成分来抑制TNF、IL等炎性因子的表达来达到治疗疖肿的目的。槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等主要化学成分能够作用于网络中的多个交集基因靶点，交集基因也与多个化学成分互相作用，这说明如意金黄散有效成分之间存在协同作用，多靶点调控来治疗疖肿。

为进一步阐述靶点之间的作用关系，对复方-疾病交集基因靶点进行蛋白互作分析。通过分析发现，IL-4、IL-6、EGFR 在网络中 Degree值较大，在网络中连接程度较高。进一步对交集基因进行GO功能富集分析，发现交集基因主要参与了白细胞-细胞黏附、蛋白质定位建立的正调控、多细胞组织内稳态等生物学过程。IL-6与IL-4同属于白细胞介素，是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。IL-6能够促进T细胞表面IL-2r的表达，增强IL-1和TNF对TH细胞的致有丝分裂作用。郭佳[18]发现在感染引起的急性炎性反应中诱导急性期反应蛋白的合成，其中以c-反应蛋白（CRP）增加尤为明显，有利于更早发现机体炎性反应。刘世国[19]发现IL-4能够促使B细胞表达和分泌IgE，介导过敏反应。EGFR通路能够有效促进有丝分裂，形成角质细胞，角质细胞也可通过EGFR刺激再生。EGF是EGFR主要配体之一，能够刺激周围神经修复和再生[20]。另外，Marino等[21]对人表皮淋巴管内皮细胞（LECs）进行体外研究，发现EGFR可以通过表达EGF来促进淋巴管形成。EGFR能够使受体配体活性增强，来促进血管淋巴管的再生，刺激周围神经的修复和再生来达到促进疮疡愈合，减轻疼痛，治疗疖肿的目的。这提示如意金黄散中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等有效成分可能是通过直接作用于IL-6、IL-4、EGFR等交集基因从而参与机体白细胞-细胞黏附、蛋白质定位建立的正调控、多细胞组织内稳态等生物学过程来达到治疗疖肿的目的。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、以及TNF信号通路。既往的研究表明，局部炎性反应是疖肿发生病变的基础，有效的控制炎性反应对治疗疖肿有明显的促进作用。在疖肿的发生发展过程中会释放大量的炎性因子（IL-2，IL-4，IL-6，IL-1α，IL-1β等），阻断IL-17信号通路能够有效抑制炎性因子的释放[22]，达到治疗的目的。杨超茅等[23]发现AGE-RACE信号通路能够激活逆转录因子（NF）-κB，从而使得细胞核表达和释放大量的黏附因子、生长因子、促炎细胞因子（IL-6，TNF-α）等，抑制炎性因子的表达，达到抗炎的作用。NF-κB又可以增强AGE-RACE信号通路的表达，使得该通路能够持久作用于细胞[24]。TNF-α和IL-6是参与机体组织损害和病理反应的炎性细胞因子[25]，阻断机体的TNF信号通路能够显著抑制TNF等炎性因子的释放和表达，如意金黄散可能是通过阻断机体的IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、以及TNF信号通路来达到抗炎，治疗疖肿的作用。

上述KEGG通路的富集结果还显示，还富集到了细胞因子间相互作用、疟疾、类风湿性关节炎、流体剪切应力与动脉粥样硬化等通路结果，这说明如意金黄散除了直接作用于炎性反应相关的信号通路，还有影响机体内多种多种代谢通路的基因靶点发挥治疗疖肿的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，分析如意金黄散治疗疖肿的机制。结果显示，如意金黄散治疗疖肿主要是通过槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等多种潜在化学成分作用于IL-6、IL-4、EGFR等基因，从而调节多种生物学功能以及多条通路来达到治疗目的。为后续进一步探讨机制和优化实验设计提供支持，同时，本文也为中药及其复方治疗某种疾病的机制分析提供了研究方法。