钙化性心瓣膜病合并肺动脉高压病人血清miR-222、白细胞介素-6、脑钠肽水平分析

周华兰 林森 李霞 徐培敬 胡有东

钙化性心瓣膜病(calcified valvular heart disease，CVHD)又称退行性心脏瓣膜病，与传统观点相反，CVHD不是一种被动的退行性疾病，而是一种动态疾病。瓣膜小叶最初的细胞变化发展为纤维化病变，导致瓣膜增厚和钙化，晚期增厚和钙化损害瓣膜功能，在没有干预的情况下，心室肥厚逐渐发生，最终导致心力衰竭和死亡。左心疾病相关性肺动脉高压(PH-LHD)主要由左心疾病引起，是肺动脉高压(PH)的常见类型之一，具有患病率高、预后差等特点。而对于左心瓣膜疾病尤其是CVHD合并PH的研究目前较少。多项研究表明，微小RNAs(miRNAs)及炎性反应参与了瓣膜病的发生、发展[1-2]。本研究旨在探讨CVHD及合并PH的病人微小RNA-222(miR-222)、IL-6、hs-CRP、N末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)的水平变化及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年8月至2019年5月在我院住院的CVHD病人158例，分为CVHD合并PH组(72例)及无PH的单纯CVHD组(86例)，其中CVHD合并PH组男38例, 女34例, 年龄60～80岁，平均(72.61±4.89) 岁；单纯CVHD组男45例, 女41例, 年龄60～80岁，平均(72.15±5.57) 岁。另选30名健康体检者作为对照组，男16例, 女14例, 年龄60～80岁，平均(72.80±5.00) 岁。所有入选者均进行超声心动图检查。PH-LHD以心脏多普勒彩超为主要诊断标准，采用三尖瓣反流法估算的肺动脉收缩压(SPAP)值进行诊断：静息状态下经胸超声心动图测得SPAP>40 mmHg,且符合《中国肺高血压诊断和治疗指南2018》中PH-LHD临床分类。排除标准:风湿性心脏瓣膜病、先天性心脏瓣膜病、胶原病及感染性心内膜炎所致的瓣膜病变。3组间年龄、性别、BMI、FPG、TG、TC、SBP、DBP比较差异均无统计学意义(P>0.05)， 具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准, 且所有入选者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集：所有入选者抽取空腹肘静脉血4 mL，离心后吸取血清，保存于-80 ℃冰箱待下一步检测。

1.2.2 血清miR-222的相对表达量检测：Trizol-离心柱法提取总RNA，检测时先进行复温, 由INVITROGEN公司提供的Trizol试剂盒提取总RNA， 严格按照说明书, 提取血清总RNA。将总 RNA 逆转录为互补 DNA(cDNA)，再经实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测方法特异性扩增，获单一熔解曲线峰(试剂盒由GeneCopoeiaTM公司提供)，软件分析得到 Ct 值，以Ct值表示miR-222表达水平，以U6作为内参照，由公式2-△△Ct计算各个样本中的miRNA相对表达量。

1.2.3 血清IL-6检测：采用ELISA法，检测仪为RAYTO RT-6000，试剂盒由上海拜力生物科技有限公司提供。严格按照说明书进行操作。

1.2.4 血清hs-CRP 检测：使用美国BECKMAN公司生产的特种蛋白免疫散射浊度分析仪AU5800检测，采用免疫比浊法，试剂盒由上海百蕊生物有限公司提供。正常参考值≤3 mg/L。

1.2.5 血清NT-proBNP 检测：采用法国MERCK公司提供的原装进口试剂盒，采用化学发光法，严格按照说明书进行操作。

2 结果

2.1 3组血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平比较 CVHD病人血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)，且CVHD合并PH组较单纯CVHD组升高更显著(P<0.01)。 见表1。

表1 3组血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平比较

2.2 相关性分析 直线相关分析表明，所有CVHD病人IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平与miR-222水平均呈正相关(r=0.438、0.384、0.540，P均<0.01)。

3 讨论

microRNA(miRNA)是一类内源性、非编码小RNA分子，可通过特异性作用降解mRNA或在转录后水平通过抑制翻译、诱导降解等方式调节相应靶基因表达。miRNA在机体健康的不同阶段和疾病不同时期的表达量发生显著变化，且具有细胞、组织特异性，在血液、组织、细胞中检测到稳定的不同浓度miRNA，可作为潜在的诊断疾病的生物标记物或防治靶点。miR-222作为miRNAs家族中的重要一员，在细胞增殖、分化、凋亡、炎性反应及多种生物组织的调节过程中发挥着重要作用。据报道，miR-222可能通过基质金属蛋白酶1的表达调控增生性瘢痕组织中成纤维细胞的生存能力[3]。钙化性主动脉瓣疾病中长链非编码RNA H19 DNA甲基化改变通过沉默NOTCH1促进其钙化[4]；在大鼠难治性骨折模型中，局部应用miR-222抑制剂可以促进成骨、软骨形成和血管生成，从而加速骨愈合[5]。本研究发现，CVHD病人血清miR-222水平明显高于对照组，且CVHD合并PH组较单纯的CVHD组病人血清miR-222水平升高更显著。有报道，PH病人的冠状动脉中，由于miR-223/DNA损伤/Poly核糖聚合酶1/miR-204轴激活和随后的溴域蛋白4过表达，促进了血管的重构和共病发展[6]。

本研究表明，CVHD尤其是合并PH的CVHD病人血清miR-222、IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平明显升高，提示miR-222及炎性反应(如IL-6、hs-CRP)等可能参与了CVHD的进展及预后。各种左心疾病包括CVHD，随着病情进展，左心室压力升高导致肺血管重构，血清NT-proBNP水平升高，肺动脉压力升高。在CVHD中，向钙化和骨化发展的过程是以瓣膜增厚为先导的，这是由于脂质、炎性细胞的积累，以及随后在瓣膜细胞外基质中的紊乱所致。而且，本研究还发现，所有CVHD病人IL-6、hs-CRP、NT-proBNP水平与miR-222水平呈正相关。提示炎性反应可能加速了瓣膜钙化的进程，引起左心功能不全、PH。有关miRNA通过炎性反应参与心脏衰老调控的更进一步探讨显示，miRNA let-7通过抑制心脏IL-6和多个胶原蛋白的表达，从而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏炎症反应及纤维化[7]；miR-222参与了缺氧诱导的肺动脉血管平滑肌细胞的增殖和迁移[8]。

因此，miR-222、IL-6及NT-proBNP联合使用可能对CVHD的病情评估及临床防治提供帮助。由于本研究的样本较少，尚需进一步的大样本前瞻性临床研究来验证其未来的作用。