枸杞多糖对获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力的影响

冯妮，陈志英，谢运法，李美珍，冯显钤，唐荣福，胡传活*，唐胤晟*，李铭*

(1. 广西大学动物科技学院，广西 南宁 530004；2. 广西畜禽品种改良站，广西 南宁 530001；3. 广西畜牧研究所，广西 南宁 530001)

随着养猪生产技术的发展，人工授精技术被广泛应用，提高人工授精效率显得尤为重要。人工授精过程中，精子发生顶体反应之前，获能是一个重要的生理先决条件[1]。而哺乳动物精子获能期间的一个早期事件是产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[2]，ROS的产生和氧化应激与氧化还原损伤直接相关[3]。研究表明，氧化应激是损伤精子质量的主要因素之一[4]。精子获能过程中产生的过多氧化物质会导致精子受精所需的结构和功能发生改变甚至丢失[5]，极大地限制了人工授精技术的广泛推广。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是一种常见天然中药提取物。近年来研究表明，LBP具有多种生物活性和药理作用，可通过调节垂体性腺轴，维持生殖激素之间的平衡，进而维持正常的生精环境[6]。此外，LBP已被证明在猪精液冷冻保存中是一种天然抗冻剂[7]。一系列研究还探讨了LBP对睾丸组织的保护作用，表明其可以通过减少睾丸组织的氧化应激进而表现出对精子的保护作用[8]。LBP不仅能够逆转镉引起的血清睾酮水平下降趋势[9]，还能阻断生精细胞凋亡的相关途径[10]。尽管研究表明LBP能用于治疗多种疾病，并作为抗氧化剂促进机体健康和长寿，但其对精子获能过程中抗氧化功能的影响研究未见报道。本试验旨在评价LBP对获能新鲜和冻后猪精子抗氧化能力的影响，为进一步提高猪的人工授精效率提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜精液，手握法采自广西科达畜禽改良有限责任公司体况相近的杜洛克公猪，按广西大学动物解剖实验室沿用方法[11]冷冻。精子培养液(Biggers-Whitten-Whittingham，BWW)购自上海美吉生物医药科技有限公司。LBP(纯度50%)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、细胞荧光凋亡Hoechst 33342/PI双染试剂盒和伊红染液，均购自北京Solarbio Science有限公司。超微量紫外分光光度计，购自天根生化科技有限公司。

1.2 精子获能处理

离心富集后的新鲜与冻后精子以PBS液1 000 r/min离心5 min洗涤。同样的离心重复2次后，加入BWW培养液，将不同浓度LBP(2、4、8和16 mg/mL)与处理后的精子混匀，按文献[12]操作孵育精子。

1.3 精子表观指标检测

按田恒玖[13]方法依次检测获能处理后猪精子活率、质膜完整性、顶体完整率。精子线粒体活性和精子细胞凋亡Hoechst 33342/PI双染按Solarbio Science公司说明操作。

1.4 精子抗氧化能力的检测

使用最佳浓度LBP处理获能精子后，分别按试剂盒操作说明测定精子T-AOC、SOD活性及MDA含量。

1.5 精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表达量分析

精子在上述处理的基础上加入1 μmol/L氯化镉处理[14]，诱导氧化应激后采用TRIzol法提取各组精子的总RNA，使用超微量紫外分光光度计测定各组别RNA的A260/A280在1.8～2.0。随后用Gene Star 反转录合成cDNA，采用华大基因有限公司合成的引物，按照SYBR Green方法检测SOD-1(上游引物:ATGGTGTGGCCACTGTGTACA；下游引物：CCACCTCTGCCCAAGTCATC)和Caspase-8(上游引物：TCAAGTTCCTGAGCCTGGAC；下游引物：GCATGACCCTGTAGGCAGA) 基因mRNA表达水平。以β-actin(上游引物：CTAGTTACACACACGCGGCTCT；下游引物：CATGAATACCCTGCACAGATCG)作为内参基因，每个样本重复3次。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

1.6 数据统计与分析

用SPSS 23.0统计学软件对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，数据用 “平均值±标准差”表示，以P<0.05 为差异显著的判断标准。用GraphPad 7.0软件对数据进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度LBP对获能新鲜和冷冻精子表观指标的影响

由表1可见，新鲜精子中，2 mg/mL LBP获能精子活率和顶体完整率显著高于空白组和16 mg/mL组(P<0.05)。2 mg/mL LBP获能精子质膜完整性达到最高(P<0.05)。由表2可见，冷冻精子中，8 mg/mL LBP的获能精子活率、线粒体活性和顶体完整率显著高于空白组、2 mg/mL组、4 mg/mL组(P<0.05)，而质膜完整性则显著低于空白组和其他试验组(P<0.05)。综合分析，选取2和8 mg/mL LBP为鲜精和冻精最适浓度。

表1 不同浓度LBP对获能新鲜精子表观指标的影响 %

表2 不同浓度LBP对获能冻后精子表观指标的影响 %

2.2 Hoechst 33342/PI双染精子凋亡情况

精子在最适浓度LBP处理后，Hoechst 33342/PI双染结果显示正常精子：弱红色荧光+弱蓝色；凋亡精子：弱红色荧光+强蓝色；坏死精子：强红色+强蓝色。图1结果显示：新鲜精子获能试验组较获能空白组中视野内正常精子数目较多；冻后精子获能试验组较获能空白组中强红色荧光信号较强，获能试验组精子坏死减少。

图1 精子Hoechst 33342/PI双染结果(标尺=50 μm)

2.3 最适浓度LBP对获能猪精子抗氧化指标的影响

T- AOC如图2所示，新鲜精子和冻后精子中，相比较获能空白组，获能试验组T-AOC均显著增加(P<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)。下同

SOD活性如图3所示，新鲜精子和冻后精子的获能试验组较获能空白组SOD活性均显著增加(P<0.05)；MDA含量如图4所示，新鲜精子和冻后精子的获能试验组与获能空白组MDA含量均差异不显著(P>0.05)。

图3 LBP对获能新鲜(A)和冻后(B)猪精子SOD活性的影响

图4 LBP对获能新鲜(A)和冻后(B)猪精子MDA含量的影响

2.4 最适浓度LBP对获能猪精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表达量的影响

由图5可知，加氯化镉诱导氧化应激后，新鲜精子和冻后精子的获能试验组较获能空白组SOD-1 mRNA表达量均显著增加(P<0.05)。

图5 LBP对获能新鲜(A)和冻后(B)猪精子SOD-1 mRNA表达量的影响

由图6可知，新鲜精子和冻后精子的获能试验组较获能空白组Caspase-8 mRNA表达量均显著下调(P<0.05)。

图6 LBP对获能新鲜(A)和冻后(B)猪精子

3 讨论

现代药理学研究显示，LBP作为一种常见的抗氧化剂，不仅能够提高辐射诱导的少弱精子症模型小鼠精子悬液SOD 活力、降低MDA含量，减轻睾丸组织氧化损伤，还能够促进生殖腺的发育和恢复[15]，提高精子数量和活力[16]，进而保护精子的抗氧化系统。人工授精过程中，在精子发生顶体反应之前，精子获能是必要的。ROS是精子获能过程中产生的物质之一，ROS调节精子获能，涉及精子与卵母细胞周围的透明带结合，诱导顶体反应，使卵母细胞受精[17]。过量的ROS，在生殖方面表现为影响精子细胞膜完整性、活率和活力等相关指标[18]。雄性生殖系统本身就是一个产生高浓度ROS的部位，易导致精子DNA损伤、中断或阻碍精卵融合，最终影响动物繁殖能力[19]。因此当抗氧化剂的含量越高时，ROS的含量就会因此下降，可促进精子保持完整的形态，提高精卵结合率。

Qiu等[20]证实了LBP可以显著提高鸡体内GSH-Px和SOD活性。LBP还可以提高大鼠血清中GSH-Px和SOD 的活性[21]。本研究发现试验组较空白组相比SOD活性升高，这一结果与上述文献报道的LBP增加SOD活性结果一致。此外，LBP可以保护雄性大鼠的生殖功能，增加线粒体膜电位进而缓解精子发生凋亡[22]。在本研究中，Hoechst 33342/PI双染细胞凋亡结果显示，较未加LBP组，加LBP组获能猪精子出现精子线粒体膜电位较高，同时，凋亡现象相对较少。LBP所含的多种糖类物质能影响膜对羟自由基的清除，从而影响精子抗氧化功能和MDA的产生[23]。然而，在本研究中，LBP对精子的MDA含量及质膜完整性没有明显的改善作用，其原因有待于进一步探索。

加氯化镉处理时，获能试验组较获能空白组，SOD-1 mRNA表达量受LBP剂量的显著影响。相比于冻后精子，新鲜精子在最适浓度LBP影响下，SOD-1 mRNA表达量上调显著，这表明在氯化镉体外诱导氧化应激过程中，LBP能显著增加获能精子抗氧化能力，进一步验证LBP在猪精子获能过程中的抗氧化作用。在人体睾丸组织中，凋亡对于睾丸发育以及精子分化具有重要作用[24]。其中Caspase在凋亡机制中起着重要的作用，主要通过线粒体途径和膜死亡受体途径介导细胞凋亡，Caspase-8 是其中最重要的启动因子之一[25]。从精子中分离出来的Caspase可以对射精后精子凋亡情况进行反映[26]。新鲜精子和冻后精子试验组Caspase-8 mRNA表达量显著下调也更好地佐证LBP能够减少获能猪精子的自我损伤。

综上所述，在新鲜或冻融猪精子获能过程中分别添加2 mg/mL和8 mg/mL LBP可以提高获能精子SOD和T-AOC活性，影响精子获能过程中SOD-1和Caspase-8 mRNA表达量，表明LBP能通过提高精子的抗氧化能力，减少精子的损伤，协助获能反应进行。