16S rRNA测序揭示猪日增重与肠道微生物的关系

吕冬玲，司景磊，莫家远，李月月，田威龙，刘笑笑，梁晶,兰干球

(广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004)

杜洛克猪原产于美国，因其瘦肉率高、生长速度快和饲料转化率高等优势，通常作为父本用来进行品种间的杂交和选育。平均日增重(ADG)是猪在某段时间内平均每日增加的重量，是衡量猪生长性状的一个重要指标。日增重高的猪能在更短的时间内达到目标市场体重，节省出栏时间，因此提高猪的日增重是猪场的育种目标之一。近年来，肠道微生物的研究不断发展，有研究发现肠道微生物在营养加工和能量的获取中起着至关重要的作用[1-2]。在单胃动物肠道中主要有3种微生物，分别是细菌、古菌和真核微生物，其中细菌是肠道中的优势微生物，尤其是厌氧细菌[3-4]。研究认为在猪生长的关键阶段，肠道微生物与其健康和生产性能具有很大关系[5-9]。HAN等[10]研究发现饲料效率较高的猪盲肠乳酸菌数量较饲料效率低的更多；Mach等[11]研究表明普氏菌与体重呈正相关，不同体重的猪，其肠道微生物在一定程度上有差异，例如，在门的水平上，厚壁菌和浮霉菌在体重较大的猪中富集，而拟杆菌富集在体重较小的猪中[12]。

目前对于杜洛克的肠道微生物与其日增重关系的研究报道较少，本试验利用高通量测序技术通过分析不同日增重杜洛克猪粪便微生物的多样性，从而分析其肠道微生物群落的结构差异及其与日增重的关系，以期为利用微生物菌群提高猪日增重、缩短出栏时间从而提高养殖效率提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和饲养管理

91头杜洛克公猪来自广西南宁某核心育种场，28日龄断奶，于相同的保育条件饲养至70日龄，平均体重(27.61±4.65)kg，随即进入安装有美国奥斯本自动喂料系统的测定站中进行性能测定，每个测定站面积为20 m2，饲喂10～12头，公母分栏饲喂，正式测定前将有10 d左右的适应期，在体重约100 kg时结束测定。育肥舍为全封闭的栏舍结构，配有湿帘风机自动控温系统、全自动温控通风设备及半漏缝水泥地板设计。试验期间饲喂相同的标准日粮，日粮成分及配方见表1，期间不添加抗生素、益生菌或药物等，自由饮水。

表1 日粮成分及配方

1.2 样品的收集与分组

调取奥斯本饲喂系统所记录杜洛克公猪测定期间的每日采食量及体重数据，利用FIRE软件统计猪在90～160日龄的平均日增重。根据91头猪的平均日增重大小，取10头日增重最高的猪作为HADG组，日增重区间1.10～1.18 kg，平均日增重(1.13±0.03) kg；10头日增重最低的作为LADG组，日增重区间 0.72～0.89 kg，平均日增重(0.80±0.07)kg。肛拭子法采集粪便，放入灭菌试管，并迅速放于液氮速冻后转至-80 ℃保存，用于后续分析。

1.3 粪便微生物的提取及16S rRNA测序

参考Fast DNA SPIN soil kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)说明书提取2组共20头猪的粪便DNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。用细菌16S rRNA基因V3-V4区的引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对以上提取的DNA模板进行扩增，选用20 μL PCR体系，PCR反应体系参考胡宗福等[13]方法，扩增产物纯化后由Illumina Miseq平台进行高通量测序并用以下软件进行微生物分析(见表2)。

表2 微生物分析方法

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0对试验数据进行处理分析，数据以“平均数±标准差”表示，显著性分析采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 猪粪便中微生物alpha多样性

以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指数作alpha多样性的参数(表3)，Coverage指数反映测序对物种的覆盖度，2组粪便微生物的Coverage均大于0.99(HADG组0.995 4，LADG组0.995 1)，证明数据是可靠的。Chao指数和Ace指数可衡量物种的丰富度，Shannon和Simpson指数可衡量物种的多样性。发现HADG组和LADG组中alpha多样性差异不显著(P>0.05)。

表3 HADG和LADG组粪便微生物alpha多样性的差异

2.2 猪粪便微生物类群的差异

在97%相似性的水平上，在门水平共检测到14个菌群(图1A)，其中有12个门是LADG与HADG组共有，厚壁菌门(Firmicutes, LADG组69.37%，HADG组66.90%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，LADG组27.10%，HADG组30.64%)是2组的优势菌门，螺旋菌门(Spirochaetes)为LADG组独有(图1C)。在属水平，共检测到114个菌群，其中107个是LADG与HADG组共有，4个LADG组独有，3个HADG组独有(图1B)，属水平上2组的优势菌群分别是普氏菌属(Prevotella,LADG组16.90%，HADG组25.28%)和乳酸菌属(Lactobacillus,LADG组12.81%，HADG组16.94%)(图1D)。

利用主坐标分析分别比较了HADG和LADG组微生物菌群在门水平和属水平上的相对丰度及其差异(图2)，在门水平上，发现LADG组的螺旋体门(Spirochaetes), 软壁菌门(Tenericutes), WPS-2以及疣微菌门(Verrucomicrobia)4个菌群的丰度要显著高于HADG组(P<0.05)(图2B)；在属水平上发现HADG组中的巨球型菌(Megasphaere)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和韦荣氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)3个菌群的丰度显著高于LADG组；瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和拟杆菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等在LADG组中富集度显著高于HADG组(图3B)。

A.门水平Venn图；B.属水平Venn图；C.门水平的群落结构；D.属水平的群落结构

A.门水平的PCoA图；B.门水平的差异菌群。其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同

2.3 粪便微生物的功能预测和KEGG通路比较

PICRUSt对OTUs的丰度进行标准化并获得相应的KEGG信息及相应的丰度值，然后用STAMP软件(version 2.1.3)进行代谢通路差异分析，以Welch’s双尾检验预测功能通路的差异性，显著性阈值为P<0.05。结果表明高低组间的4条通路有显著性差异(P<0.05)，其中LADG组中细胞运动和信号转导的丰度显著高于HADG组(P<0.05)；Poorly characterized通路极显著地富集在HADG组中(P<0.01)，代谢疾病通路的丰度显著高于LADG组(P<0.05)(图4A)。KEGG的三级代谢通路预测发现了LADG和HADG 2组有24条显著差异的三级通路，其中HADG组中的无机离子的转运和代谢、Ⅱ型糖尿病通路的丰度极显著高于LADG组，脂类生物合成蛋白通路丰度LADG组极显著地高于HADG组(图4B)。

3 讨论

下一代测序技术拓宽了遗传育种的研究领域[9]。Mach等[11]提出早期肠道微生物的丰度对宿主的性状至关重要，同时也有助于种猪的早期选择。从公式：选择进展=选择差×选择强度/世代间隔[14]，可以看出选择强度和选择差的提高及世代间隔的减小均可增加选择进展，尤其是对遗传力较低的一些性状。

本研究将杜洛克公猪分为LADG和HADG 2组，并对2组猪的粪便微生物群落进行对比分析和功能预测。以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指数作alpha差异分析的参数，Coverage指数反映测序对物种的覆盖度，2组粪便微生物的Coverage均大于0.99，证实了数据的可靠性。Chao指数和Ace指数可衡量物种的丰富度，Shannon和Simpson指数可衡量物种的多样性[15]。alpha差异分析显示2组微生物的丰富度都很高，HADG组Chao指数和Ace指数2个指数比LADG组高但并不显著，说明一定程度上HADG组物种有更高蛋白丰富度；HADG组的Shannon指数比LADG组高，Simpson指数比LADG组低，但差异不显著，说明一定程度上HADG组的微生物群落多样性更丰富。

前人研究发现不同猪不同生长阶段的肠道微生物组成有差异，这可能与其生长状态等有关系，仔猪在出生后0～2 d和7 d～断奶前的肠道微生物组成从以好氧和兼性厌氧菌为主(主要为葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌属)过渡到严格厌氧菌为优势菌群(主要为厚壁菌群和拟杆菌群)[16]；Wang等[17]研究了仔猪从出生(0日龄)到上市(174日龄)的粪便微生物结构群落，表明厚壁菌门和拟杆菌门是猪从出生到上市的优势菌门；Mach等[11]研究表明普氏菌与体重呈正相关；Pajarillo等[18]发现在门水平杜洛克、长白和大白3个猪种的微生物结构是相似的，主要以厚壁菌门和拟杆菌门为主。本研究结果发现，厚壁菌门和拟杆菌门是门水平的2个优势菌群，这与Si等[19]的研究结果一致；螺旋体门、软壁菌门，WPS-2以及疣微菌门这4个菌群在LADG 组的丰度要显著高于 HADG 组，表明这4个菌群的群落结构可能对猪的日增重有负相关作用；在属水平上2组的优势菌群均是普氏菌(Prevotella)和乳酸菌(Lactobacillus)，这一结果与杨慧[20]的结果相一致；HADG组中的巨球型菌(Megasphaere)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和韦荣氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)这3个菌群的富集显著高于LADG组，推测这4个菌群可能与日增重有正相关作用，可促进杜洛克猪的生长和发育；还发现一些菌群在LADG组中富集度显著高于HADG组，例如瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和拟杆菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等，初步推测瘤胃菌和拟杆菌群的富集对猪的日增重有负相关作用。

A.属水平的PCoA图；B.属水平的差异菌群

A.二级代谢通路；B.三级代谢通路

猪不同日增重的差异可能还与微生物的代谢途经有关，KEGG的二级通路分析发现HADG组的疾病代谢和Poorly characterized通路的富集要显著高于LADG组，表明HADG组相较LADG组有更强的疾病代谢能力；KEGG的三级通路分析发现HADG组的无机离子的转运和代谢、谷胱甘肽的代谢、氨基糖和核苷酸糖的代谢、核黄素代谢、嘌呤代谢和亚硒化合物的代谢通路的富集度显著高于LADG组，提示HADG组的营养物质的代谢水平更高。核黄素即VB2，是机体生长发育必不可少的一种维生素，可以促进机体碳水化合物、核酸等物质的代谢，增加机体的抗氧化能力的同时降低心血管疾病发生的风险等[21]；嘌呤是核酸的重要组成成分，对机体的新陈代谢也有重要意义，大多数动植物细胞尤其在动物内脏器官中都含有大量的嘌呤，嘌呤的大量堆积可能会导致尿酸的沉积，进而引发痛风等嘌呤代谢障碍性疾病[22-23]。三级通路中脂肪酸的生物合成、分泌系统通路富集LADG组显著高于HADG组，病原体入侵宿主细胞会对宿主的免疫系统产生影响[24]，细菌可以利用宿主的分泌系统来破坏宿主的一些功能，Rapisarda等[25]通过对比革兰阳性和革兰阴性细菌各自分泌系统的结构组成，发现这些结构与其自身的毒性有关。推测粪便微生物与宿主的相互作用可能与其分泌系统的功能也有一定相关。

4 结论

厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是LADG和HADG组的优势菌门，普氏菌属(Prevotella)和乳酸菌属(Lactobacillus)是这2组的优势菌属。2组微生物在代谢通路上有差异：微生物在疾病代谢尤其是嘌呤代谢和核黄素代谢等通路高度富集在HADG组中；而微生物的分泌系统等通路高度富集在LADG组中。提示HADG组的代谢水平更高，LADG组的分泌系统较HADG组更发达。这一结果为理解早期宿主与猪肠道微生物相互作用提供了帮助，对仔猪的早期选育提供了新的思路。