猪源马链球菌兽疫亚种分离鉴定

邓汝森，张海龙，颜广智，陈盛楠,2，顾万军,2，黄良宗,2*

(1. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000；2. 广东方道基因科技有限公司，广东 佛山 528000)

马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)属于兰氏分群的C群，是马链球菌的一个亚种，具有宿主多样性，可通过外伤、手术等途径感染多种动物[1-3]，在中国主要流行于猪群和马群[4]。引起马腺疫的病原体除了马链球菌马亚种，还有马链球菌兽疫亚种也是主要病原体之一[5]。马链球菌兽疫亚种主要引起猪的脑膜炎、关节炎、肺炎、败血症以及突然死亡等[6]。该菌也可以感染人，是一种重要的人畜共患病病原体[7]。

类M蛋白(SzP)是马链球菌兽疫亚种的重要毒力因子和主要的保护性抗原[8]，具有多种生物学功能。SzP作为该菌菌体表面一种生物大分子，与其他表面大分子一样经受各种选择性压力作用，在进化过程中，会以一定的频率发生变异，特别是因免疫选择性压力，其表面保护性抗原位点会因点突变而发生改变[9]。因此，SzP基因的变化能代表马链球菌兽疫亚种的进化规律和趋势。

2018年7月中旬，广东省江门市某规模化猪场保育仔猪突然发生散发性急性死亡，猪场共有保育猪650头，发病76头，死亡17头，发病率11.69%，死亡率2.62%。经调查，该猪场于2018年6月初注射猪链球菌2型灭活疫苗，发病后未用抗菌药物进行治疗。随后立即剖检病猪，经一系列细菌学检测手段判定分离菌为马链球菌兽疫亚种，通过小鼠致病性试验研究该分离菌对小鼠的致病力以及结合体外药敏试验筛选敏感药物，以期为临床防控马链球菌兽疫亚种引发的疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料

猪脑组织样品，采集于广东省江门市某规模化养殖场临床表现为神经症状的病猪。

1.2 主要试剂和实验动物

PCR扩增试剂盒、DL2000 DNA Marker、Gold view 染料、氨苄青霉素、pMD18-T载体连接试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司；细菌DNA抽提试剂盒购自美基(Magen)生物公司；大肠埃希菌DH5α和马链球菌兽疫亚种质控菌株ATCC 43079由佛山科学技术学院生命科学与工程学院预防兽医学重点实验室保存；药敏纸片购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；细菌微量生化鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司；血清营养琼脂平板(含10%小牛血清)、10%小牛血清肉汤、氨苄平板及LB液体培养基(氨苄浓度：100 mg/mL)和鲜血营养琼脂平板均由佛山科学技术学院预防兽医重点实验室配制。48只5～7 周龄雄性BALB/c小鼠购于广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2019-0035。

1.3 细菌分离与鉴定

1.3.1 细菌分离鉴定与形态学观察

无菌操作采取脑顶叶划线接种于血清营养琼脂平板(含0.01% NAD)，37 ℃培养24 h后观察菌落生长情况及形态，挑取疑似单菌落在血琼脂平板纯化培养。挑取纯培养的单菌落制作抹片，革兰染色，观察细菌形态特征。

1.3.2 细菌生化鉴定

按照单盒生化鉴定管使用说明书，对分离菌进行生化鉴定，并与伯杰细菌鉴定手册(第8版)的生化结果进行比较。

1.3.3 细菌16S rRNA基因序列分析及SzP氨基酸序列分析

挑取纯培养单菌落接种于10% 小牛血清肉汤，37 ℃、160 r/min恒温震荡培养24 h，按照细菌DNA抽提试剂盒说明书的操作过程抽提分离菌总DNA 用作PCR反应的模板。参考文献[10]合成马链球菌兽疫亚种SzP基因特异性引物，并用16S rRNA基因进行PCR扩增，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性产物做胶回收，并把回收产物连接到 pMD-18T 载体，连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，旋转混匀，置冰浴30 min，42 ℃水浴热休克90 s后，迅速置冰浴5 min，加入1 mL LB培养液，37 ℃恒温摇床培养45 min，4 500 r/min常温离心5 min，吸取1 mL上清，将余液细胞均匀涂布于氨苄抗性的LB琼脂培养基，37 ℃培养16 h。各挑取5个阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司进行测序。

表1 引物序列信息

1.4 小鼠毒力试验

取培养至对数生长期的菌液，4 ℃、5 000 r/min离心10 min收集菌体。用生理盐水重悬，调整原液，使100倍稀释后的菌液OD600约为0.2，进行连续的10倍梯度稀释并进行平板计数以确定实际接种量。同时选取4.87×104～4.87×108CFU细菌量接种5～7 周龄雄性BALB/c小鼠(腹腔注射0.1 mL/只)，每组8只，另设阴性对照组注射生理盐水，连续观察7 d，每天记录小鼠的死亡情况，最后采用Karber法[11]计算半数致死量(LD50)。及时解剖死亡小鼠，观察小鼠脏器变化，取脑组织和肺脏抹片，革兰染色镜检；同时取脏器涂抹鲜血平板，置37 ℃培养24 h后进行细菌纯化鉴定。

1.5 药敏试验

将纯培养的细菌致密划线接种于血清营养琼脂平板表面。用无菌镊子将氟苯尼考、替米考星、环丙沙星、大观霉素、多西环素、庆大霉素、林可霉素、头孢噻肟、氧氟沙星、头孢曲松、阿莫西林、恩诺沙星、青霉素、阿米卡星、复方新诺明和复方阿莫西林16 种药敏片均匀贴至培养基表面，倒置平板，37 ℃培养24 h，按美国临床实验室标准化委员会的药敏试验标准，根据抑菌圈直径大小来判定结果。

2 结果

2.1 细菌形态观察及生化鉴定

用无菌接种环将分离单菌落划线接种于鲜血平板，37 ℃培养24 h，可见圆形、微隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、灰白色、半透明的菌落，呈现明显的β溶血(图1A)，革兰染色镜检可见长短不一的链状球菌(图1B)，分离菌命名为SEZ20180618。通过细菌微量生化鉴定管检测分离菌SEZ20180618的生化指标，结果马尿酸盐、山梨醇、海藻糖、甘油和七叶苷呈阳性，6.5%高盐肉汤、菊糖、阿拉伯糖和甘露醇呈阴性，符合马链球菌兽疫亚种生化特性。结合细菌形态和生化结果可初步判断分离菌为马链球菌兽疫亚种。

2.2 细菌16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA通用引物对分离菌株SEZ20180618进行PCR扩增，产物经纯化后连接pMD18-T载体测序。16S rRNA基因产物大小为1 466 bp(图2)。将测序结果与GenBank中参考菌株16S rRNA基因序列进行同源性比对，发现分离菌株SEZ20180618的16S rRNA与马链球菌兽疫亚种同源性>97%。采用MEGA7.0 软件对分离菌株与参考菌株的16S rRNA基因序列构建系统进化树，结果显示，菌株SEZ20180618与马链球菌兽疫亚种处于同一分支(图3)。结合分离菌株SEZ20180618的形态观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA基因序列分析，最终判定分离菌株SEZ20180618为马链球菌兽疫亚种。

A.血平板上生长；B. 革兰染色镜检(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker；1. 阴性对照; 2. 16S rRNA基因; 3. 阴性对照; 4. SzP基因

注：▲为本试验分离株

2.3 SzP氨基酸序列分析

对SzP基因进行PCR扩增，产物大小为364 bp(图2)，利用MegAlign软件中的Clustal W将测序结果与GenBank登录的SzP基因序列进行同源性比较，发现分离菌株SEZ20180618与马链球菌兽疫亚种参考菌株CT株(GU332844.1)、Cxy012株(AY263783.1)、SH00166株(AY263784.1)、HNC01株(EF421188.1)、47A株(KF214274.1)、FC04株(EF522946.1)、SEZ9407473D株(AF519472.1)和C3株(MH287001.1)的SzP氨基酸序列同源性达100%。

2.4 小鼠毒力试验

小鼠腹腔按梯度注射SEZ20180618菌株死亡情况见表2。小鼠在攻毒12 h后出现精神沉郁、食欲降低、打堆等临床症状，之后小鼠接连死亡。剖杀死亡小鼠，取脾脏、肝脏和脑等器官划线分离细菌，均可分离出与马链球菌兽疫亚种菌落形态、生长特性和生化特性相一致的细菌，并对分离菌用马链球菌兽疫亚种SzP基因特异性引物PCR可扩增出与预期片段大小的条带。根据表2计算SEZ20180618对小鼠的LD50为1.54×106CFU。

表2 SEZ20180618菌株对小鼠的LD50测定

2.5 药敏试验

分离菌SEZ20180618对复方阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、环丙沙星、大观霉素、多西环素、庆大霉素、林可霉素、头孢噻肟、氧氟沙星、头孢曲松、阿莫西林、恩诺沙星和青霉素共14 种抗生素均敏感；对阿米卡星、复方新诺明2种抗生素中度敏感(表3)。

表3 SEZ20180618药敏试验结果

3 讨论

马链球菌兽疫亚种是引起多种动物发病死亡的重要病原体，同时该菌经特定的途径也可感染人，是一种重要的人畜共患病病原。本试验对采自广东省江门市某规模化猪场表现神经症状并死亡的保育猪的脑组织样品进行细菌分离，获得1株革兰阳性链状排列的球菌，该株分离菌在鲜血平板上呈现β溶血，结合细菌生化鉴定、16S rRNA及SzP基因克隆测序分析，确定该株分离菌为马链球菌兽疫亚种，命名SEZ20180618。

对分离纯化培养的SEZ20180618进行小鼠毒力试验，结果表明该菌株对BALB/c小鼠的LD50为1.54×106CFU，表明该株分离菌是具有较强毒力的马链球菌兽疫亚种，由此推测马链球菌兽疫亚种可能是该场保育猪发生神经症状死亡的重要原因之一。

体外药敏试验对临床筛选敏感抗菌药物治疗疾病具有指导性作用[12]。药敏试验结果表明：分离菌SEZ20180618对复方阿莫西林、氟苯尼考、多西环素、阿莫西林、恩诺沙星、青霉素等14种抗菌药物均敏感；对阿米卡星、复方新诺明2种抗菌药物中度敏感。临床应根据体外药敏试验结果选择敏感抗菌药物进行治疗，同时应将发病猪隔离饲养，减少病原菌传染，加强对猪舍环境的消毒工作，同时保持通风干燥的环境，减少病原菌滋生。

本研究通过实验室诊断方法确诊引起该猪场保育猪发生神经症状死亡的病原是马链球菌兽疫亚种，为临床诊断和治疗提供可靠依据，同时对马链球菌兽疫亚种感染的流行病学调查和候选疫苗菌株的选择提供了实验室参考依据。