贵州省部分牛场BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情况调查及BVDV分子特征分析

石柯，刘巧玲，张森，林泠，任杰，汤德元，曾智勇，王彬，明东东，李思南，黄涛

(贵州大学动物科学学院， 贵州 贵阳 550025)

牛病毒性腹泻(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的急性、热性传染病，可引起免疫抑制，以发热、腹泻、怀孕母牛流产或产出死胎、畸形胎为主要症状。怀孕母牛可将病毒垂直传播给新生小牛，引起持续感染，牛终生带毒，这也是该病很难彻底根除的最主要原因[1]。牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)是状病毒科乙型冠状病毒属成员，为线状单股正链RNA病毒，是导致犊牛腹泻的重要病原[2]，该病毒也可引起成年牛的冬痢和呼吸道疾病，且易发生混合感染[3]。BCoV所引起的犊牛呼吸道疾病通常表现为亚临床型，多见于12～16周龄犊牛，可出现轻度呼吸道症状，如鼻炎、咳嗽和喷嚏，也可侵害下呼吸道[4]。该病毒是在肠道上皮及上呼吸道上皮内复制的一种环境性病原，饲养管理不当、严寒湿润、应激等因素可促使BCoV感染，常呈地方流行性，发病过的牛场几年内可连续感染，临床上难以净化[5]。牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus type 1，BHV-1)是导致牛传染性鼻气管炎(IBR)主要病因，临床上以急性、高热、呼吸困难、流鼻液、上呼吸道及其气管黏膜发炎为主要症状[6]。我国于1980年首次从新西兰引进的牛群中分离到BHV-1[7]。目前该病在我国牛群中的流行呈上升趋势，给养牛业造成了巨大的经济损失[8]。牛支原体(Mycoplasmabovis，MB)是牛的一种重要的致病性支原体，其主要引起牛的肺炎和乳腺炎，也可引起关节炎和流产[9-10]。本次试验通过对贵州省7个地区牛场所采集的样品进行PCR检测，并对阳性样品进行测序与分析，旨在了解贵州省牛BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情况。在BVDV基因组中5′-UTR是最保守的基因序列[11]，E2基因是BVDV的囊膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶点[12]，因此5′-UTR和E2基因常用于BVDV的分子特征分析靶标[13]。通过对BVDV分子特征分析，了解贵州省流行的BVDV亚型，为贵州省牛BVD进一步防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2018年2月—2020年4月间采集贵州不同地区牛场的牛鼻拭子共224份，其中：贞丰县35份、大方县33份、铜仁市28份、关岭县45份、都匀县27份、开阳县18份和凯里市38份。所有样品均为随机采样。

1.2 主要试剂

分子量标准物DL2000 DNA Marker、M-MLV酶、dNTP、Oligo Primer、RNA酶抑制剂、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、pMD19-T Vector、大肠杆菌DH5α感受态细胞，均购自大连宝生物工程有限公司；金牌Mix(green)购自武汉擎科创新生物公司；EZNATM Gel Extraction Kit(50)胶回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 样品检测

处理过的样品采用DNA/RNA提取试剂盒对采集的224份样品进行核酸提取。将提取的核酸产物置于-20 ℃保存备用。将提取的病毒RNA反转录成cDNA，按照Magen公司M-MLV H-First Stand Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行。将反转录的cDNA置于-20 ℃保存备用。

1.4 PCR检测

参照NCBI中发表的BVDV 5′-UTR(MK059454)、BCoVgN(NC003045)、MBuvrC(AF003959)、BHV1gB(AJ004801)等基因的序列，运用Primer 5.0设计引物，用于扩增目的基因片段，BVDV E2基因选择借鉴王梦心等[14]的引物设计方法，引物序列详见表1。引物由武汉擎科创新生物公司合成。

表1 扩增目的片段的引物

PCR反应体系为25 μL，金牌Mix(green)21 μL，上、下游引物各1 μL，DNA或cDNA模板各2 μL，PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；退火温度54 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，共进行35个循环；72 ℃ 10 min；所有检测样品均设阳性和阴性对照。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

将BVDV的5′-UTR和E2基因的PCR扩增产物回收纯化，纯化的PCR扩增产物送去武汉擎科创新生物公司克隆测序。从GenBank中获取 BVDV基因1、2型部分代表株15株(详见表2)，作为序列参考，利用生物分析软件MEGA7.0及DNAman进行对比分析，构建进化树。

表2 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 PCR检测

采用PCR方法对各个县市的样品进行检测，部分样品检出特异性条带，说明存在病毒感染，结果如图1～4。

由表2可见，各个县市BVDV阳性率在11.11%～18.19%，平均阳性率15.67%；BHV-1阳性率在0～15.15%，平均阳性率7.37%；BCoV阳性率在0～14.28%，平均阳性率7.46%；MB阳性率5.56%～17.14%，平均阳性率12.50%。其中BVDV和MB的混合感染率为0～6.06%；BVDV和BHV-1的混合感染率为0～3.03%，MB和BHV-1的混合感染率为0～3.57%，MB和BCoV的混合感染率为0～3.70%。未发现3种及其以上的病毒同时感染的病例。

M. DL2000 DNA Marker；1. 阳性对照；2～6. 部分样品；7. 阴性对照

M.DL2000 DNA Marker；1. 阳性对照；2～6. 部分样品；7. 阴性对照

M.DL2000 DNA Marker；1. 阳性对照；2～6. 部分样品；7. 阴性对照

M.DL2000 DNA Marker；1. 阳性对照；2～6. 部分样品；7. 阴性对照

表2 贵州省部分地区牛BVDV、MB、BHV-1、BCoV病原学调查结果分析 %

2.2 BVDV 5′-UTR基因与E2基因序列进化树分析

系统进化树分析表明(如图5、图6所示)，4份BVDV阳性样品均为BVDV-1型，其中有3份为BVDV-1m亚型，1份为BVDV-1b1亚型。样品GUIZOU-1、GUIZOU-2、GUIZOU-3与BVDV-1m型毒株ZM-95遗传关系相近，属于同一分支，有较近的亲缘关系；GUIZOU-4与BVDV-1B1型毒株VEDEVAC遗传关系接近。

注：▲GUIZOU-1、GUIZOU -2、GUIZOU -3、GUIZOU -4均为本次试验阳性样品。下同

图6 BVDV E2基因遗传进化树

3 讨论

BVDV、BCoV、BHV1和MB是引起牛呼吸道综合征的主要病因，并且以多重感染或混合感染为主要感染形式[8, 14-15]。BVDV 5′-UTR的核苷酸序列呈现高度保守性，因此常作为核苷酸序列设计特异性引物，对BVDV进行检测和分离鉴定[16]。童钦等[17]调查了内蒙古部分地区的509份牛血清样品，BVDV抗体阳性率为58.35%。姚伟等[18]对辽宁省的739份血清样品进行了流行病学调查，BVDV抗体阳性率为74%。刘泽余等[19]对吉林省的325份血清样品进行了抗体和抗原的检测，BVDV抗体阳性率为77%，抗原阳性率为12.92%。姚志兰等[20]对2016—2017年在江浙部分地区采集了145份临床腹泻犊奶牛血清样品进行检测，BVDV阳性率为13.1%。而西部病原调查的数据不全。本次研究只对贵州部分县市进行BVDV病原检测，平均阳性率为15.67%。高于吉林省并且与江浙部分地区相近，说明贵州地区有较多的BVDV感染牛。何美琳等[21]对四川省阿贝州8个县市1 070份牛血清样品进行检测，发现BCoV的抗体阳性率为84.11%。权英存等[22]通过RT-PCR方法，检测了青海省部分地区具有明显腹泻症状牛的肠道、粪便等样品32份，发现BCoV阳性率为34.38%。2015—2017年，He等[23]采集西藏、青海藏区、四川藏区和云南藏区3月龄以内牦牛腹泻粪便样本共 336 份，平均阳性率为69.05%，其中西藏为68.33%，青海为71.67%，四川为69.23%，云南为66.67%。本次研究中发现贵州部分县市BCoV的平均阳性率7.46%，远远低于其他地区，分析可能原因是本次研究中的样品均采用的牛鼻拭子而其他研究多采用牛腹泻粪便样本。王淑娟等[24]对北京、天津、陕西、山东、山西、河南、河北等地的奶牛场进行了调查，结果显示BHV-1的个体阳性率在0～55.00%，群体阳性率为77.8%。本次研究中BHV-1平均阳性率仅为7.37%，处于一个比较低的水平，可能是由于选取的牛多为成年牛并且多为自家养殖，并没有大规模与周边地区频繁交易，所以平均阳性率普遍低于其他省市。根据张信军[25]对76份临床样品检测，BVDV与BHV-1混合感染率为6.58%，并且该研究并未发现3种病毒的混合感染。本次研究中BVDV和MB的混合感染率0～6.06%；BVDV和BHV-1的混合感染率0～3.03%，MB和BHV-1的混合感染率0～3.57%，MB和BCoV的混合感染率0～3.70%，并且没有发现3种及其以上的感染病例。

由于中国地域辽阔，物种繁多，疾病的流行及病毒的遗传演化情况十分复杂。研究表明，已从中国牛群中分离到BVDV-1和BVDV-2型病毒。中国主要流行的亚型为BVDV-1b和BVDV-1m型，其中青藏高原的主要流行亚型是BVDV-1q和BVDV-1b型，新疆地区分离到的病毒主要为BVDV-1q和BVDV-1f亚型[26]。为了进一步了解贵州地区牛场BVDV流行株的亚型，本次研究还对其中的4份阳性样品进行测序，使用MEGA7生物学软件和GenBank下载的15株毒株进行遗传演化分析，结果显示，本次研究的3份阳性样品GUIZOU-1、GUIZOU-2、GUIZOU-3与参考株ZM-95亲缘性比较近，并且处于同一分支，同属于BVDV-1m型；GUIZOU-4与VEDEVAC亲缘关系比较接近，为BVDV-1b。本次样品的采集主要集中于贵州地区，但是VEDEAVC是匈牙利的毒株。蔡元庆等[27]在新疆也发现同源性接近匈牙利毒株的毒株，所以推测可能是新疆地区牛群传播到贵州省或从欧洲引种传播到贵州省。本研究发现的2种BVDV亚型与我国主要流行的亚型基本吻合，为分析贵州地区BDVD的流行提供了参考意义。

本次研究首先从病原学方面对贵州省部分地区的牛场进行了BVDV、BHV-1、BCoV、MB感染的流行病学调查，并且针对BVDV的基因型、基因亚型的感染情况进行了进一步的研究，证实了贵州地区牛场存在多种疾病和BVDV多种基因型的感染，为贵州省进行牛呼吸道疾病的防控提供了可靠的依据。