注射用头孢噻呋钠在牛奶中的残留消除研究

陈晨,董朕，张东辉，李冰，程富胜，张继瑜，周绪正

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

头孢噻呋又名赛得福，是第一个专门用于动物的头孢菌素类抗生素，由Upjohn公司研制并被用于兽医领域，产品是钠盐形式的Naxcel®无菌粉[1]。头孢噻呋的抗菌谱广，可通过抑制细菌细胞壁的合成从而达到快速杀菌的作用[2-3]，广泛用于畜禽养殖业[4]，但不规范使用会导致药物残留，引起细菌耐药性增加，危害环境，而且通过食物链和环境直接或间接危害人类健康。欧盟制定头孢噻呋在牛奶中的最大残留限量(MRL)为100 μg/kg[5]；我国规定其在牛奶中的MRL为100 μg/kg，且规定其残留标识物为去呋喃甲酰基头孢噻呋(DFC)[6]。

头孢噻呋进入动物体内后，绝大部分快速转化为DFC等代谢物[7-9]，因为DFC在动物体内不稳定，动物体内的内源性物质会干扰DFC的直接检测，所以通常检测时先将不稳定的DFC转化为稳定的乙酰胺去甲基头孢噻呋(DCA)，可通过采用二硫赤藓糖醇将DFC与蛋白质偶联，进而通过碘乙酰胺处理生成稳定的DCA[10]。我国农业农村部1025号公告[11]颁布的用于动物性食品中头孢噻呋残留检测的高效液相色谱法操作复杂、重复性差、灵敏度低。因此，本研究建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法用于检测牛奶中头孢噻呋残留，以期更好地了解该药物在牛奶中的残留消除规律并制定休药期。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

头孢噻呋标准品：纯度97.7%，购自Dr.Ehrenstirfer GmbH；乙腈、甲醇和甲酸：质谱纯，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；二硫赤藓醇：纯度99%，购自国药集团化学试剂有限公司；碘乙酰胺：纯度98%，购自上海阿拉丁试剂有限公司；十四水合硼酸钠、氯化钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠：购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸：购自天津市科密欧化学试剂有限公司；二甲基亚砜：色谱纯，购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 试验动物

选取甘肃省某奶牛场的20头荷斯坦奶牛(高产、低产奶牛各10头)。所有牛在近1月内未使用头孢噻呋类及与头孢噻呋类结构相似的药物。体型大小、精神状态、膘情等均需符合健康状态，体重在250～450 kg。

1.3 给药和样品采集

注射用头孢噻呋钠，粉针剂，规格为1.0 g，生产批号：DVK181001，由河北远征药业有限公司提供。按推荐剂量每千克体重2.2 mg肌肉注射给药，连续3 d。于第1次给药后4、12 h，第2次给药后4、12 h，以及最后一次给药后4、8、10、12和 24 h，采集4个乳区的混合奶样，用于测定。

1.4 HPLC-MS/MS检测牛奶中头孢噻呋残留

1.4.1 试剂的制备与保存

①取空白牛奶样品作为空白试样，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。②取储备液(1 mg/mL)依次用超纯水配置成50、100、200、400、600、1 000 μg/kg标准工作溶液。③0.05 mol/L硼酸缓冲液：称取19 g十四水合硼酸钠和3.7 g氯化钾溶于900 mL水中，调节pH=9，用水定容至1 L。④0.025 mol/L磷酸缓冲液：将3.5 g磷酸二氢钠溶于900 mL水中，调节pH=7.0，用水定容至1 L。⑤0.4% DTE提取液：称取1.0 g二硫赤藓醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液中(现配现用)。⑥14%碘乙酰胺溶液：称取7.0 g碘乙酰胺，溶于50 mL 0.025 mol/L磷酸缓冲液中(现配现用)。⑦25%磷酸溶液：取25 mL磷酸，加水溶解并稀释至100 mL。⑧-20 ℃以下保存样品。

1.4.2 样品前处理方法

提取和衍生：取牛奶(1±0.01) g，加入标准溶液，涡动10 s，加0.4%二硫赤藓糖醇溶液11 mL，涡动2 min，55 ℃水浴振荡15 min，取出放置室温，加14%碘乙酰胺溶液3 mL，避光室温下静置衍生30 min，用25%的磷酸缓冲调节pH值至2.3左右，4 500 r/min、4 ℃离心20 min，上清液转移至另一支50 mL离心管中待用。

净化：依次用10 mL甲醇、10 mL水活化C18萃取柱，取离心后的上清液过柱，用5 mL水淋洗之后，用6 mL 90%甲醇水溶液洗脱，洗脱液用氮吹仪吹干，用复溶液(0.1%甲酸水∶0.1%甲酸乙腈=80∶20)复溶残余物，超声10 min后，过0.22 μm滤膜，进行HPLC-MS/MS分析。

1.4.3 色谱条件

流动相：0.1%甲酸水，0.1%甲酸乙腈，流速：0.4 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。高效液相色谱的洗脱条件如表1所示。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

1.4.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，质谱扫描模式采用多反应监测，离子源温度：100 ℃，脱溶剂温度：350 ℃，毛细管电压：4 000 V，脱溶剂气流速：11 L/min，定性离子对(m/z)：487>210，定量离子对(m/z)：487>241，锥孔电压：110 V，碰撞能量：15 eV。

1.4.5 特异性

分析空白奶样(n=20)，观察在药峰出现的区域是否有干扰。

1.4.6 标准曲线

分别设置7个不同浓度的标准工作液，依次为50、100、200、400、600和1 000 μg/kg，依据设定浓度加入标准品，添加头孢噻呋于空白牛奶样品中，按照前述方法进行提取、净化、复溶，HPLC-MS/MS检测，以所得峰面积为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制基质标准曲线，得到相应的基质标准曲线回归方程与相关系数。

1.4.7 方法的检出限(LOD)与定量限(LOQ)

采用最常见的检出限与定量限的确定方法，即信噪比(S/N)法：分别以3倍信噪比和10倍信噪比作为检出限和定量限。

1.4.8 方法的准确度与精密度

用添加回收试验验证方法的准确度，用回收率表示准确度。按照前述“1.4.2”方法处理样品，选择LOQ(50 μg/kg)、MRL(100 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)进行添加回收，每个浓度5个重复，进行3次单独试验。

按照前述“1.4.2”方法处理样品，选择LOQ(50 μg/kg)，2LOQ(100 μg/kg)，10LOQ(500 μg/kg)，每个浓度5个样品，重复测定3次，分别计算回收率和批内相对标准偏差以及批间相对标准偏差。

1.4.9 方法的稳定性

方法的稳定性包括反复冻融3次的稳定性，8 h室温放置稳定性以及长期冻融稳定性。按照前述“1.4.2”方法处理样品，选择LOQ(50 μg/kg)、2MRL(200 μg/kg)进行添加回收，在样品反复冻融3次前后、在前处理时(记为0 h)和处理后8 h以及长期冻融后检测，分析药物在牛奶中的稳定性。

1.5 数据处理与分析

每头牛每个时间点分别取3个平行奶样检测，取其平均值作为最终检测结果，应用WTM1.4软件计算头孢噻呋在牛奶中的弃奶期(WT)。

2 结果

2.1 特异性

分析不同来源的空白牛奶样品，目标化合物的保留时间附近没有杂质干扰，牛奶空白基质色谱如图1所示。

图1 牛奶空白基质特征离子质量色谱

2.2 标准曲线与检测限以及定量限

在50～1 000 μg/kg的浓度范围内，方法的线性关系良好，相关系数>0.99，头孢噻呋的方法检出限为25 μg/kg，其色谱如图2所示，定量限50 μg/kg，其色谱如图3所示。

图2 头孢噻呋衍生物DCA的检测限色谱

图3 头孢噻呋衍生物DCA的定量限色谱

2.3 准确度

选择50、100和200 μg/kg进行添加回收，每个浓度计算回收率，结果如表2所示，3个添加浓度的回收率为96.48%～100.19%，满足《兽药残留试验指导原则》[12]。

表2 加样回收率结果 %

2.4 精密度

由表3可知，选择50、100和500 μg/kg为添加浓度进行方法精密度考察，批内精密度为2.09%～11.22%，批间精密度2.36%～12.31%(RSD，变异系数)。结果满足《兽药残留试验指导原则》[12]。

表3 精密度试验结果

2.5 稳定性

2.5.1 待测药物在冻融过程中的稳定性

由表4可知，添加50和200 μg/kg的头孢噻呋标准品在牛奶样品冻融过程中，待测物的变异系数为10.39%和12.67%。

表4 待测药物在冻融过程中的稳定性

2.5.2 待测药物室温放置8 h稳定性

由表5可知，添加50 和200 μg/kg头孢噻呋标品进行前处理后，室温放置8 h稳定性检测，待测物的变异系数为10.08%和8.48%。

表5 待测药物室温放置8 h的稳定性

2.5.3 待测药物在牛奶中的长期稳定性

由表6可知，分别添加50 和200 μg/kg的头孢噻呋标准品于牛奶中混匀，分别在冷冻当日(记为0)和冷冻1月进行前检测，分析待测药物在牛奶中的稳定性，变异系数分别为7.47%和8.08%。

表6 待测药物在牛奶中的长期稳定性

2.6 牛奶中头孢噻呋钠的浓度

按照本研究建立的方法，对采集的牛奶样品进行检测。在第1次给药后4和12 h，牛奶中去呋喃甲酰基头孢噻呋的残留量均低于规定的MRL(100 μg/kg)，且大多数采样点的残留量低于定量限(LOQ=50 μg/kg)。连续3 d给药后，对所有奶牛在给药后4、8、10、12和24 h采集奶样进行残留分析，其中18头奶牛的奶中去呋喃甲酰基头孢噻呋的大多数都低于定量限，也小于规定的MRL，这表明头孢噻呋钠在奶牛体内代谢快。其中3087号奶牛在第3次给药后10 h以及3513号奶牛在第3次给药后4 h去呋喃甲酰基头孢噻呋的浓度分别为113.79和166.10 μg/kg，高于MRL，其余奶牛在所有采样点的浓度均低于MRL。这表明奶牛体内残留消除存在差异性，可能和个体体态等因素有关。

2.7 牛奶中头孢噻呋钠的休药期

头孢噻呋钠的MRL为100 μg/kg，通过WTM1.4软件计算注射用头孢噻呋钠的弃奶期为7.148 h，弃奶期结果如图4所示。

图4 头孢噻呋钠在牛奶中的残留消除规律

3 讨论

头孢噻呋属于β-内酰胺类抗生素，主要用于治疗禽畜的细菌性呼吸道感染等疾病，临床效果好，优于传统的磺胺、氯霉素、庆大霉素及恩诺沙星、泰乐菌素、氟苯尼考等，无任何明显的毒副作用，耐药率相对较低[13-14]，应用范围广。因此，对该药物在食品动物中的残留检测就显得尤为重要。

HPLC-MS/MS方法因其具有良好的适用性和高灵敏度，常在抗生素残留检测中发挥重要的作用[15-16]。本研究建立了头孢噻呋在原料奶中的药物残留HPLC-MS/MS检测方法，经过梯度洗脱，优化色谱、质谱条件，优化了国家标准方法中固相萃取柱的选择，样品只需经过C18萃取柱1次，简化了之前方法中繁琐的过柱程序，操作简单。其色谱峰的保留时间在3 min左右，峰形尖锐，两边对称，并对其进行了方法学考察，方法灵敏度好，回收率高，检测限可达25 μg/kg，满足国内外对于该药的检测要求[17]。

对于所有肌肉注射给药的奶牛，按照试验设计的采样点进行残留分析，除1头奶牛在第3次给药后10 h以及1头奶牛在第3次给药后4 h去呋喃甲酰基头孢噻呋的浓度分别为113.79和166.10 μg/kg，其余奶牛在所有采样点的浓度均低于最大残留限量。 由以上数据可看出，奶牛按照推荐剂量给药后，牛奶中残留标识物去呋喃甲酰基头孢噻呋消除较快。据报道，给奶牛肌肉注射2.2 mg/kg的14C-头孢噻呋，在最后一个剂量后10 h牛奶中残留量最多，残留量为71 μg/kg，到12 h降到40 μg/kg[5]。本研究中相同时间点残留量略有不同，但在最后一次给药后12 h残留量都低于定量限，也低于最大残留限量，这可能与奶牛的个体差异有关，但是总体残留消除趋势与国外其他报道基本相符[5,18]。除去异常值，包括残留最高点在内的各个时间点残留量均低于我国农业部规定的最大残留限量。

国外对于头孢噻呋的研究已经证明，头孢噻呋残留量低，高效安全，FDA已经确定其无牛奶弃奶期[19]。但是我国缺乏该药在牛上的残留数据，也没有相关弃奶期的规定。基于此，我们进行了注射用头孢噻呋钠在牛奶中的残留消除试验，以期了解该药物在牛奶中的残留消除规律并制定休药期。通过WTM1.4软件计算注射用头孢噻呋钠在牛奶中的弃奶期为7.148 h。为了确保动物食品安全，防止个体差异，以及考虑到临床实际操作等，参考标准以及本次试验的结果，建议将注射用头孢噻呋钠的弃奶期定为12 h。

综上，本研究建立的注射用头孢噻呋钠的HPLC-MS/MS检测方法，特异性强、回收率高、重复性好，检测限为25 μg/kg，定量限为50 μg/kg，满足头孢噻呋钠在牛奶中的残留检测要求。根据其残留消除规律建议头孢噻呋钠在牛奶中的弃奶期为12 h。