噻呋酰胺对河南省小麦纹枯病菌的抑制活性

徐建强，张 勇，杨 岚，平忠良，李佳婷， 夏彦飞，郑 伟，林晓民

(1.河南科技大学林学院，河南洛阳 471003; 2.安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽合肥 230031)

近年来，由禾谷丝核菌AG-D融合群引起的小麦纹枯病(wheat sharp eyespot)在中国小麦种植区普遍发生，已成为仅次于条锈病和赤霉病的主要病害[1-2]。由于目前生产中尚无对纹枯病高抗或免疫的小麦品种[3]，控制该病主要依靠三唑酮、苯醚甲环唑和戊唑醇等药剂，但已出现对这些药剂的敏感性表现下降的菌株，生产中需筛选防治该病的替换药剂[4-5]。琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHIs)属于酰胺类杀菌剂的一类，近年来，SDHIs类杀菌剂新品迭出，且新品上市后需求量增长迅速，引起了国内外广泛关注[6]。SDHIs类杀菌剂中的氟酰胺对小麦纹枯病菌有很好的抑制活性[7]；而噻呋酰胺则对水稻纹枯病的防效明显[8-9]。在中国农药信息网有关噻呋酰胺登记用于水稻的信息有130条[10]。有研究结果[11-13]表明噻呋酰胺对小麦纹枯病菌也有很强的抑制活性；任学祥等[14]研究发现，噻呋酰胺包衣对小麦纹枯病的防效可达90%左右，显著高于同等剂量的其他药剂，且对小麦安全。然而，在中国农药信息网有关噻呋酰胺登记用于小麦的信息只有4条[10]，并且尚无噻呋酰胺对河南省小麦纹枯病菌抑制活性的系统报道。因此，本研究采用菌丝生长速率法测定噻呋酰胺对2016年从河南省15个地市分离的98株病菌菌丝生长的抑制活性，以期为噻呋酰胺在河南省小麦纹枯病综合防控中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与药剂

从2016年分离自河南省15个地市的228株病菌中，每地市随机选取3～12株，共98株菌株用于试验。97%噻呋酰胺(thifluzamide)原药由江苏省镇江农药厂生产；97%苯醚甲环唑(difenoconazole)原药由先正达(中国)投资有限公司生产；97%戊唑醇(tebuconazole)原药由广西田园生化股份有限公司生产；62.5%井冈霉素(jinggangmycin)原药由浙江钱江生物化学股份有限公司生产；97.6%甲基立枯磷(tolclofos-methyl)原药由江苏省东海农药厂生产。井冈霉素预溶于灭菌超纯水，其他杀菌剂预溶于丙酮或甲醇，均配成10 mg·mL-1母液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

用菌丝生长速率法测定纹枯病菌对不同药剂的敏感性。在平板培养基中添加不同浓度的药剂作为处理组，其中，噻呋酰胺的质量浓度为0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1 μg·mL-1，苯醚甲环唑的质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.5、2.5和5 μg·mL-1，戊唑醇的质量浓度为0.003、0.005、0.01、0.03、0.05和0.1 μg·mL-1，井冈霉素的质量浓度为0.15、0.2、0.25、0.35、0.5和1 μg·mL-1，甲基立枯磷的质量浓度为0.035、0.065、0.1、0.2、0.3和0.5 μg·mL-1；以不含药剂的PSA平板培养基为对照，25 ℃培养5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，并计算药剂对菌丝生长的抑制率。菌丝生长抑制率=(对照菌落直径平均值-处理菌落直径平均值)/(对照菌落直径平均值-菌饼直径)×100%。

1.3 数据分析与处理

在得到抑制率的基础上，采用Excel 2007和DPS 6.55软件的“数量型数据机值分析”模块计算药剂抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数和有效中质量浓度(EC50值)，并进行EC50值的正态性分布检验，以正态性分布的EC50值的平均值作为病菌对噻呋酰胺的敏感性基线[5]。采用DPS 6.5软件的LSD法进行差异显著性检验；采用SPSS 20.0软件进行聚类分析[5]；参照徐建强等[15]的方法分析噻呋酰胺与其他杀菌剂对纹枯病菌毒力间的相关性。

2 结果与分析

2.1 小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感基线

菌丝生长速率测定结果显示，随着噻呋酰胺质量浓度的增加，其对病菌的抑制作用逐渐增强，当其质量浓度达到1μg·mL-1时，对所有供试菌株的抑制率均已达到90%以上，对个别菌株的抑制率达到100%，说明噻呋酰胺对小麦纹枯病菌有很强的抑制作用。进一步分析发现，供试病菌对噻呋酰胺的EC50值为0.009～0.405 μg·mL-1，且EC50最大值是最小值的44.47倍，平均值为0.070±0.061 μg·mL-1，EC50值的分布整体呈连续性分布(图1-A)。Shapiro-Wilk结果显示，菌株对药剂的敏感性(即EC50值)分布不符合正态分布(W=0.740，P=0.000<0.05)，说明小麦纹枯病菌群体中存在对噻呋酰胺敏感性较低的亚群体；但有75.51%的菌株(74株)位于主峰内，呈连续单峰频次的近似正态分布(W=0.968，P=0.054>0.05)，其EC50平均值为0.043±0.019 μg·mL-1(图1-B)，故将此值作为纹枯病菌对噻呋酰胺的相对敏感基线。

图1 小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感性(A)及敏感性频率分布(B)

表1 河南省不同地区小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感性Table 1 Sensitivity(EC50 value) of R.cerealis to thifluzamide from different areas in Henan province

变异倍数为EC50最大值与最小值之比；表中同列数据后小写字母不同表示取样地点间差异显著(P<0.05)。

Variable ratiois the ratio of maximum to minimum of EC50values of isolates from the same region.Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 levelfor different sampling sites.

2.2 不同地区的菌株对噻呋酰胺的敏感性

由表1可知，同一地市内的菌株对噻呋酰胺的敏感性差异明显，其中，差异最大的为取自平顶山市的菌株，其EC50值的变异倍数达34.89倍；其次为取自南阳市的菌株，为27.24倍；取自漯河市的菌株差异最小，仅1.78倍；其他地区菌株为2.13～9.84倍。

而不同地市菌株对噻呋酰胺的敏感性差异不太明显，噻呋酰胺EC50平均值为0.035～0.155 μg·mL-1，其中，鹤壁市菌株的EC50值为0.035 μg·mL-1，最为敏感，许昌市菌株的EC50值为0.155 μg·mL-1，最不敏感，两者的EC50值相差4.41倍。方差分析表明，取自鹤壁、漯河、郑州3市的菌株对噻呋酰胺敏感，但其敏感性与除南阳、许昌2市外其他10个地市菌株的差异均未达到显著水平。

2.3 菌株对噻呋酰胺敏感性水平的系统聚类分析

每地市随机选取3个菌株，共45株，利用SPSS软件对噻呋酰胺抑制菌株菌丝生长的EC50值进行聚类分析。结果(图2)表明，噻呋酰胺对45个菌株的EC50值分在5个聚类组，包含的菌株数分别为16、16、3、9及1个。各市的菌株均出现在不同的聚类组，说明同一个市的菌株间存在较大差异；除第Ⅴ聚类组外，其他聚类组包含河南省大部分市的菌株，说明不同地区菌株对噻呋酰胺的敏感性差异不明显，这与表1中方差分析的结果一致，进一步说明病菌对噻呋酰胺的敏感性差异与菌株来源的地理位置无显著相关性。

图2 抑制小麦纹枯病菌菌丝生长的噻呋酰胺中质量浓度(EC50值)的系统聚类分析

2.4 噻呋酰胺和其他药剂对纹枯病菌毒力间的相关性分析

噻呋酰胺和苯醚甲环唑、戊唑醇、甲基立枯磷、井冈霉素4种药剂对纹枯病菌毒力间的相关性分析表明，药剂毒力之间的P值均小于0.05，而戊唑醇和甲基立枯磷的斜率为正，苯醚甲环唑及井冈霉素的斜率为负，但其决定系数(R2)均小于0.8，说明噻呋酰胺和其他4种药剂对病菌的毒力间无明显相关性(图3)。这意味着生产中噻呋酰胺可以与这些药剂轮换或交替使用，从而延长药剂的使用寿命。

3 讨 论

本研究结果表明，河南省小麦纹枯病菌对噻呋酰胺具有较高的敏感性。同一地市菌株对药剂敏感性的差异较大，这可能是由菌株本身的生理差异及群体组成的多样性引起的；但不同地市菌株间对药剂的敏感性差异不明显，说明河南省各地区的用药水平基本相同。徐建强等[5,15-16]在研究河南省小麦纹枯病菌对苯醚甲环唑、戊唑醇、井冈霉素、甲基立枯磷、咯菌睛的敏感性时均得到了相同的结论。尽管有对药剂敏感性较低的亚群体，但所占比例较低，噻呋酰胺可作为小麦纹枯病化学防治的备选药剂应用于农业生产。

本研究建立的小麦纹枯对噻呋酰胺的相对敏感基线略低于齐永志等[11]以及Zhang等[13]建立的基线，这可能与菌株来源的地理位置不同有关。齐永志等选用的菌株中有83.7%的菌株取自河北省，仅11.4%的菌株取自河南省鹤壁市[11]；Zhang等所用菌株有89.2%的菌株取自江苏省，取自河南省商丘市的菌株仅占2.5%[13]。因此，两者的研究结果分别能更好地反映河北省和江苏省小麦纹枯病菌对噻呋酰胺敏感性的现状。而本研究的菌株全部采自河南省，研究结果更能全面反映河南省小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感性。

图3 小麦纹枯病菌对噻呋酰胺和其他4种杀菌剂敏感性间的相关性

齐永志等[11]、Zhang等[13]及Sun等[17]的研究均表明，小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗药性风险属于中低等。Sun等[17]研究显示，病菌对噻呋酰胺中等及低等水平的抗药性分别是由病菌琥珀酸脱氢酶基因RcSdhB、RcSdhC及RcSdhD发生点突变引起。这表明噻呋酰胺可以连续用于小麦纹枯病的化学防治。但为延长药剂的使用寿命，生产中可将噻呋酰胺与其他药剂混合或轮换使用。齐永志等[11]的研究表明，噻呋酰胺与戊唑醇、咯菌腈、井冈霉素、三唑酮、丙环唑及多菌灵之间无交互抗性关系。本研究对EC50值的回归分析也表明，噻呋酰胺对纹枯病菌的毒力与苯醚甲环唑、戊唑醇、甲基立枯磷、井冈霉素4种药剂间无明显相关性，说明在生产中可将噻呋酰胺与这些药剂轮换或交替使用，从而延长其使用寿命。