基质金属蛋白酶2、血管内皮生长因子在胆囊癌中的表达及与患者预后的关系

田德福，吴宏，杨洲明

1陕西省第四人民医院普外科，西安 710043

2陕西省西电集团医院普外科，西安 710074

胆囊癌指胆囊组织出现的恶性病变，且多发生于胆囊底部、体部、颈部及胆囊管。胆囊癌作为临床常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率居消化系统恶性肿瘤的第5 位，但胆囊癌的临床症状缺乏特异性，早期诊断较为困难，一经确诊恶性程度就已经较高，增加了胆囊癌患者的临床治疗难度，降低了患者的生存率，增加了患者及家属的精神及经济压力。肿瘤细胞的迁移、侵袭可影响患者的预后及治疗效果，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可有效促进内皮细胞和肿瘤新生血管生成，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成员MMP2 可降解细胞外基质，增强了细胞浸润过程中突破细胞外基质的能力。本研究探讨MMP2、VEGF 在胆囊癌患者中的表达及与患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年1 月至2017 年12 月陕西省第四人民医院和陕西省西电集团医院收治的胆囊癌和胆囊息肉患者。纳入标准：①手术病理活检确诊为胆囊癌或胆囊息肉；②均为首次确诊，入院后均接受根治性手术治疗；③术前无相关抗肿瘤药物使用史；④未接受肿瘤相关放疗、化疗等治疗。排除标准：①合并一定程度的肝脏系统疾病（肝炎、肝硬化等）；②合并呼吸、循环等系统病变，存在一定程度的脑血管疾病；③合并精神系统疾病，无法正常交流；④病历资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入96 例胆囊癌患者和96 例胆囊息肉患者。胆囊癌患者中男52 例，女44 例；年龄60～79 岁，平均（71.4±4.02）岁；美国癌症联合委 员 会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7 版TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期36 例，Ⅳ期4 例；分化程度：低分化17 例，中分化30 例，高分化49 例：病理类型：腺癌81 例，鳞状细胞癌15 例；淋巴结转移56 例，无淋巴结转移40例；浸润深度：浅肌层35 例，深肌层43 例，全肌层18 例。胆囊息肉患者中男63 例，女33 例；年龄60～79 岁，平均（72.0±3.16）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清MMP2、VEGF水平

术前1 天及术后1 周，取两组患者空腹静脉血2 ml置于抗凝管内，静置2 h，1000 r/min离心20 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA 检测两组患者血清MMP2、VEGF、VEGFC 受体VEGFR3（Flt4）水平，按照说明书要求进行标准品的稀释及加样、孵育，并采用酶标仪在450 nm 处检测光密度值（optical density，OD），计算样本浓度。

1.3 免疫组化法检测不同组织中MMP2、VEGF 蛋白表达情况及结果判定

取胆囊癌患者的胆囊癌组织和胆囊息肉患者的胆囊息肉组织，切片，室温脱蜡，予以适量的2%过氧化氢清除内源性过氧化物酶，经过微波修复处理，予以适量的5%山羊血清封闭处理，加入一抗（MMP2、VEGF），4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育10 min，再予以适量的二氨基联苯胺溶液染色。结果判定：VEGF 定位于细胞质或细胞膜，每个视野下10%以上胆囊癌细胞质（或细胞膜）呈棕黄染色判定为阳性。MMP2定位于细胞质，以视野中细胞质呈棕色或褐色染色，且着色程度明显重于背景色，判定为阳性，仅对呈阳性表达的细胞进行最终的计数（间质染色除外）。根据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分：依据染色强度评分，未着色计0 分、着色弱计1 分、中等着色计2 分、着强色计3 分；依据阳性细胞所占比例评分，阳性细胞所占比例为1%～25%计0 分、阳性细胞所占比例为26%～50%计1分、阳性细胞所占比例＞50%计2分。将染色强度和阳性细胞比例评分相加，0～2 分判定为MMP2、VEGF 蛋白表达阴性，3～5分判定为MMP2、VEGF蛋白表达阳性。

1.4 随访

胆囊癌患者术后，采用电话、门诊随访等方式进行为期3 年的随访，随访截止时间为2020 年12月，记录胆囊癌患者的生存情况。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比较

术前1 天，观察组患者血清MMP2、VEGF、Flt4水平均明显高于对照组患者，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。术后1 周，两组患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明显低于本组术前1 天，且观察组患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明显高于对照组患者，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表1）

表1 手术前后两组患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比较

2.2 不同组织中MMP2、VEGF蛋白表达情况的比较

胆囊癌组织中MMP2 蛋白的阳性表达率为64.58%（62/96），明显高于胆囊息肉组织的35.42%（34/96），差异有统计学意义（

χ

=16.333，

P

=0.000）；胆囊癌组织中VEGF 蛋白的阳性表达率为42.71%（41/96），明显高于胆囊息肉组织的0%，差异有统计学意义（

χ

=52.133，

P

=0.000）。（图1）

图1 胆囊癌组织和胆囊息肉组织中MMP2、VEGF蛋白表达情况（免疫组化染色，×400）

2.3 不同临床特征胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2、VEGF 蛋白表达情况的比较

不同性别、病理类型胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2、VEGF 蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。随着浸润深度的加深，胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2、VEGF 蛋白阳性表达率逐渐升高，差异均有统计学意义（

χ

=12.409、21.751，

P

＜0.05）；TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、分化程度为低分化胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2 蛋白阳性表达率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移和分化程度为中高分化的患者，差异均有统计学意义（

χ

=9.383、32.752、5.052，

P

＜0.05）；TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、分化程度为低分化胆囊癌患者胆囊癌组织中VEGF蛋白阳性表达率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移和分化程度为中高分化的患者，差异均有统计学意义（

χ

=37.825、16.082、22.852，

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2、VEGF蛋白阳性表达情况的比较

2.4 生存情况的比较

随访3 年，MMP2 阳性表达胆囊癌患者3 年内复发转移4 例，病死22 例；MMP2 阴性表达胆囊癌患者3 年内复发转移1 例，病死4 例；MMP2 阳性表达胆囊癌患者3 年生存率为64.52%（40/62），低于阴性表达患者的88.24%（30/34），差异有统计学意义（

χ

=5.572，

P

=0.018）。VEGF 阳性表达患者3 年内复发转移3 例，病死20 例；VEGF 阴性表达胆囊癌患者3 年内复发转移1 例，病死2 例；VEGF 阳性表达胆囊癌患者3 年生存率为51.22%（21/41），明显低于VEGF 阴性表达患者的96.36%（53/55），差异有统计学意义（

χ

=27.100，

P

=0.000）。

3 讨论

肿瘤的发生发展过程受多个层级、多个环节的共同调控，是一种比较复杂的生物学行为表达的过程，且肿瘤细胞具有局部浸润、转移能力，监测肿瘤细胞侵袭、转移过程中肿瘤标志物的表达情况，能有效预测肿瘤及患者的预后。

本研究结果显示，术后1 周，两组患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明显低于本组术前1 天，且观察组患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明显高于对照组患者，表明手术可在一定程度上维持患者体内VEGF、Flt4、MMP2 的平衡，观察组患者术后虽然存在一定程度的下降，但仍始终高于对照组患者，表明VEGF、Flt4、MMP2 可能与胆囊癌有一定关联。因此，本研究进一步探讨MMP2、VEGF 表达情况与胆囊癌的关系发现，胆囊癌患者通过手术切除病变组织，可在一定程度上减轻胆囊癌细胞的侵袭、浸润及转移，同时，MMP2 的高表达可降解细胞基质膜及相关结构，从而促进恶性肿瘤细胞表达多种恶性生物学信息，促进下游因子VEGF 的表达，刺激内皮细胞增殖，增加血管通透性，促进血管内皮细胞的生成；而VEGF 在血管内皮细胞中高表达可与特异性受体Flt4 结合，促进局部组织内VEGF 的表达，从而促使肿瘤细胞向淋巴迁移及自身的生长及转移。本研究结果显示，随着浸润程度的加深，MMP2、VEGF 水平逐渐升高，TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、分化程度为低分化胆囊癌患者胆囊癌组织中MMP2、VEGF蛋白阳性表达率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移和分化程度为中高分化的患者，与王绍勇和邓小凡的研究结果一致。

本研究结果显示，随访3 年，MMP2 阳性表达胆囊癌患者3 年生存率为64.52%，低于MMP2 阴性表达患者的88.24%，VEGF 阳性表达胆囊癌患者3年生存率为51.22%，低于VEGF 阴性表达患者的96.36%。这可能是因为肿瘤细胞不同的浸润深度及分化程度使MMP2、VEGF 的表达存在差异，且随着肿瘤细胞浸润肌层程度的加深，TNM 分期的增大、分化程度的降低，均可导致MMP2、VEGF 的表达上调。此外，存在淋巴结转移的胆囊癌患者胆囊癌组织MMP2、VEGF 阳性表达率升高，表明胆囊癌发展程度越高，肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭情况越明显，肿瘤细胞迁移和浸润能力的增强还可促使肿瘤新生血管内MMP2、VEGF 蛋白的表达，从而促使胆囊癌细胞间质血管网及淋巴管的大量产生，可促进肿瘤细胞进一步向淋巴管转移，不同分化程度胆囊癌患者MMP2、VEGF 的差异，可以作为肿瘤患者病情严重程度的监测指标，同时也对预测肿瘤患者的预后有重要意义，与Zhao等的研究结果一致。

综上所述，胆囊癌患者血清MMP2、VEGF、Flt4 的表达水平较高，且MMP2、VEGF 蛋白的表达情况对胆囊癌患者的预后有一定的预测价值，其阳性表达患者预后较差。