传代培养对嵌合型非整倍体计数嵌合比例的影响＊

王 兴，杨 静 ,刘芙蓉，郝胜菊，张 钏 ,刘自华

（1.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050；2.兰州大学第二医院儿童发育行为科，甘肃 兰州 730050 3.兰州大学第二医院输血科，甘肃 兰州 730050）

关键字：传代培养；嵌合体；非整倍体

人类正常体细胞是包括22 对常染色体和1 对性染色体（XX/XY），属于二倍体生物细胞。当整倍体染色体中缺少或额外增加一条或若干条染色体时称为非整倍体，一般是在减数分裂时一对同源染色体不分离或提前分离而形成n-1 或n+1 的配子，这类配子彼此结合或同正常配子(n)结合，产生各种非整倍体细胞。较为常见的非整倍体有21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征以及性染色体数目异常导致的克氏/特纳综合征等[1]。而在非整倍体患者存在一种特殊类型，即同时存在正常细胞和非整倍体细胞的嵌合体，该类患者的病情轻重往往与其异常细胞的嵌合比例及来源胚层相关[2]。

染色体核型分析是目前诊断非整倍体异常最常用的方法，但该方法检测前需要进行细胞培养，尤其是羊水细胞常需要传代培养。本研究通过对两例嵌合型非整倍体患者外周血细胞进行传代培养，使用FISH 检测计数异常核型细胞的嵌合比例，探讨传代培养对嵌合型非整倍体计数嵌合比例的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2019 年在我院确诊的1 例嵌合型21-三体综合征患者和1 例嵌合型特纳综合征患者，经患者知情同意，采其外周血样本进行研究。

1.2 方法

①细胞培养：肝素抗凝管采集患者3mL 外周血，取0.5mL 作为原代分析样本；取0.2mL 接种于外周血淋巴细胞培养液（河南赛诺特生物技术有限公司）中37℃培养细胞培养箱中培养72h 后，取0.5mL 样本作为传代1分析样本；取0.2mL 培养后样本再次传代培养72h 后，取0.5mL 样本作为传代2分析样本。

②FISH 实验：采用含GLP13/21、CSP18/X/Y 两组荧光探针的FISH 非整倍体检测试剂盒（北京金菩嘉试剂有限公司），经外周血组织标本经制片处理后进行荧光原位杂交实验。

③FISH 结果判读：使用徕卡DM6000B 荧光显微镜观察，GLP13/21 探针组中GLP21 探针示红色信号，CSP18/X/Y 探针组中CSPX 示绿色信号、CSPY探针示红色信号，选择背景干净、信号清晰、形态完整的细胞，计数200 个细胞内FISH 的杂交信号。

2 结果

对两例样本三个培养水平（原代、传代1、传代2）的FISH 检测结果显示，

嵌合型21-三体综合征和特纳综合征患者的外周血淋巴细胞进传代培养后，异常细胞所占比例逐渐下降。嵌合型21-三体综合征异常细胞比例分别为94.5%（189/200）、82.5%（165/200）、69.5%（139/200）；嵌合型特纳综合征异常细胞比例分别为71.0%（142/200）、36.5%（73/200）、27.5%（55/200）。检测结果见表1。

表1 FISH 检出异常核型细胞比例

3 讨论

嵌合型非整倍体患者体内同时包含两种以上核型的细胞系，其临床表现严重程度往往与异常细胞的嵌合比例呈正相关，异常核型细胞占比越高，其临床表现越重；反之，则越轻。然而，也有少数病例会出现核型比例与临床症状不相关的现象，这可能与体细胞镶嵌体有关[3]。

国内研究显示在实施胎儿羊水细胞培养染色体核型分析时出现嵌合体的情况达0.29%～0.46%[4～6]，并且进行后续脐血核型分析时，部分嵌合体转正常。出现这种情况，有学者认为是羊水细胞包括了胎儿三个胚层的细胞，而脐血来源于循环系统，属于中胚层细胞，故两个检测结果存在偏差可能是由于检测样本胚层来源不同造成的[5,7]。同时根据Hook等人[8]曾提出“救援”细胞系(rescue line)学说，认为存活的特纳综合征患者，在个体不同组织当中必定存在“救援”细胞系，患者才能够存活，即认为特纳综合患者体内除45，X0 核型外，具有正常的46，XX细胞系作为“救援”细胞系存在于患者发育的不同阶段或不同组织中。基于上述假设，目前常规染色体核型分析方法检测到70%特纳综合征患者为染色体嵌合体核型，其余30%患者有可能存在的嵌合体核型没有被准确检出。

传代培养在细胞生长不良时，可大大提高细胞的培养成功率，尤其在产前羊水细胞培养中，减少对孕妇及胎儿二次羊水穿刺伤害[9]。本研究意在探讨传代培养对嵌合型非整倍体计数结果的影响，我们使用两例已确诊嵌合型非整倍体外周血淋巴细胞进行传代培养，使用FISH 技术计数，结果显示异常核型细胞占比在传代培养后逐渐降低，该结果与Atkins[10]和Sultana[11]等人对嵌合型特纳综合征患者进行研究显示培养后的性腺组织细胞中异常核型占比较培养前减少相符，说明在体外细胞培养中不同细胞系间可能存在生长优劣势的差异性。

因此，嵌合型染色体核型的检出受到分析细胞数目、检测样本类型、检测方法以及体内外不同细胞系的优势生长等因素影响，导致最终的分析结果无法与患者的表型完全相符。根据本研究中显示的传代培养中正常核型细胞处于优势生长的现象，在临床工作中选择性的传代培养进行核型检测，有利于嵌合型非整倍体的检出率；同时，原代细胞能更好的反应患者真实嵌合比例情况。