锈赤扁谷盗侵染后小麦自身挥发性化合物动态变化研究

郝佳容 黎天天 陈 鑫 姜 彬 刘兴泉 张 涛

(浙江农林大学农业与食品科学学院1，杭州 311300)(国家粮食和物资储备局科学研究院2，北京 100037)(国家留学基金管理委员会信息资源部3，北京 100044)

锈赤扁谷盗Cryptolestesferrugineus(Stephens)属鞘翅目(Coleoptera)扁谷盗科(Laemophloeidae)，是一种常见的储粮害虫，广泛分布于世界各地的温带和热带地区[1]。它是一种菌食性害虫，常出现于有霉菌或腐败的粮食上，相对于质量完好的粮食而言，有霉变的粮食更为其所喜食[2]。近年来，锈赤扁谷盗危害严重、防治困难，给储粮安全带来严重影响[3-5]。

小麦是全世界三大谷物之一，总产量位居第二的粮食作物。中国是世界最早种植小麦的国家之一。小麦挥发性化合物在储藏过程的变化规律与品质有很好的相关性，可作为品质劣变的早期指标[6]。小麦储藏过程中，除了其本身气味以外，还包括储藏周期内小麦自身的各种代谢作用以及害虫侵染产生的挥发性化合物[7]。目前，已有研究报道，小麦在储藏过程中产生的挥发性化合物主要为一些羟基化合物，如醛、酮，还有少量醇类等[8]。张玉荣等[9]利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)对蛀蚀性害虫侵染后小麦的挥发性成分进行研究，发现随着侵害时间的延长，侵染后小麦的多类化合物出现下降或上升的趋势。张蓝月[10]、袁建等[11]利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)对不同储藏条件下的小麦粉挥发性成分进行研究，发现小麦粉中挥发性成分含量最高的是烃类，其次为醛类、醇类、酮类。

固相微萃取(Solid-Phase Micro-extraction，SPME)技术是近年来快速发展起来的一种主流技术，具有高效、自动、灵敏、无溶剂萃取等优点[12]。目前固相微萃取的方式主要分为2种[13]，一是浸入固相微萃取(DI-SPME)，纤维膜直接浸入液体样品中对中低挥发性化合物进行富集；二是顶空固相微萃取(HS-SPME)，纤维膜暴露于样品中，对液态-气态基质进行吸附[14]。固相微萃取技术常与气相色谱质谱联用技术(GC-MS)相结合，对样品中挥发性化合物进行定性、定量分析，广泛应用于环境、食品和生物中[15-19]。

本实验利用SPME-GC-MS技术，研究不同虫口密度锈赤扁谷盗侵染后以及不同储藏周期内小麦挥发性化合物的动态变化，探究在2个因素的影响下，小麦挥发性化合物的种类及其含量变化，建立小麦挥发性化合物与储藏品质的联系，为小麦储藏过程中的快速检测技术、风险评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦(鲁源502)：河北省衡水市2018年冬小麦，含水量12.7%。将小麦样品装入自封袋中，于-4 ℃条件下储存1周，以除去小麦中的有害生物[20]，后置于4 ℃冰箱中储存备用。小麦粉：采用小型实验磨粉机将部分低温冷冻处理后的小麦进行磨粉备用。

试虫：锈赤扁谷盗，郑州品系，由国家粮食和物资储备局科学研究院害虫饲养室饲养。饲料：全麦粉、燕麦片和酵母粉按质量比5∶4∶1混合饲料。培养条件：(25±0.5) ℃、(65±5)% RH，实验采用羽化后1～2周的成虫。

试剂：乙腈(HPLC级)。

1.2 仪器与设备

HWS恒温恒湿培养箱，FW-400小型磨粉机，7890A/5975C气相色谱质谱联用仪，(5%)-二苯基(95%)-二甲基亚芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，2 cm聚二甲基硅氧烷/碳分子筛/二乙烯苯(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm萃取进样头，20 mL顶空萃取瓶，HH-4数显恒温水浴锅，5427R离心机，KQ-250DE超声清洗器。

1.3 方法

1.3.1 锈赤扁谷盗侵染实验

培养瓶瓶口涂抹一层聚四氟乙烯，晾干后在电热鼓风干燥箱中80 ℃烘1 h，冷却后用于侵染实验，可防止锈赤扁谷盗逃逸。往培养瓶中加入76 g小麦和4 g小麦粉，混匀；按照3组虫口密度接种，1组为空白对照组(WCF-CK)，接种0头锈赤扁谷盗成虫，另外2组分别接种10头锈赤扁谷盗成虫(WCF-10)和100头锈赤扁谷盗成虫(WCF-100)。采用滤纸封口后，放入(25±0.5) ℃、(65±5)% RH培养箱中培养4周，每周取样进行测定。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS检测条件

萃取条件：参照牛永浩[20]、Laopongsit等[21]方法的基础上，对萃取条件进行优化。优化后，称取8 g样品于20 mL顶空瓶中密封，萃取温度70 ℃，水浴平衡30 min，萃取时间70 min，250 ℃解析3 min。

色谱条件：采用(5%)-二苯基(95%)-二甲基亚芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为氦气，流速为1.0mL/min，保持恒定流速；色谱柱升温程序：柱初温为45 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至250 ℃，在250 ℃保持5 min，整个升温程序共运行51 min，选择不分流进样模式。

质谱条件：进样口温度250 ℃，接口温度280 ℃，离子源为EI源，四极杆质谱，四极杆温度为150 ℃，离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，采用质谱全扫描方式进行信息采集，质谱质量扫描范围为50～550 amu，溶剂延迟时间为2 min。

1.3.3 DI-SPME-GC-MS检测条件

萃取条件：称取8 g样品于20 mL顶空瓶中，加入10 mL乙腈，振荡30 s，6 000 r/min离心3 min，取上清液1 mL于2 mL进样瓶中，将SPME手动进样器针头插入待测液底部萃取50 min，270 ℃解析15 min。

气相色谱条件：采用(5%)-二苯基(95%)-二甲基亚芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为氦气，流速为1.2 mL/min，保持恒定流速；色谱柱升温程序：柱初温为60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升温至200 ℃，再以5 ℃/min的速度升温至300 ℃，保持4 min，整个升温程序共运行57 min。

质谱条件：接口温度280 ℃，离子源为EI源，四极杆质谱，四极杆温度为150 ℃，离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，采用质谱全扫描方式进行信息采集，质谱质量扫描范围为50～550 amu，溶剂延迟时间为3 min。

1.3.4 定性定量分析

将GC-MS检测出的各化合物质谱图与NIST08标准质谱库和Wiley8标准质谱库中的质谱图比对，结合保留指数来对化合物进行定性分析。统计匹配度大于80的有机化合物，采用峰面积归一化法对挥发性成分进行定量分析。

1.4 数据处理

采用 Microsoft Excel 进行数据预处理；应用SIMCA-P(Version 14.1)程序对不同处理组数据进行PLS-DA判别分析，通过置换检验(Permutation Test)的显著性对模型进行稳定性检验，再根据变量投影重要性(VIP)值的显著性对差异化合物进行筛选；采用TBtools分析软件对差异化合物进行热图绘制及层次聚类分析(HCA)。

2 结果与分析

2.1 不同储藏周期小麦挥发性化合物的质谱分析

采用DI-SPME-GC-MS技术，对不同储藏周期小麦样品的挥发性化合物提取分析，小麦样品挥发性物质的总离子流图(图1)。结合化合物匹配度、保留时间、保留指数等信息对数据进行鉴定，共定性出18种挥发性化合物成分，详见表1。大部分化合物随储藏周期的延长呈波动变化，没有明显趋势。其中棕榈酸、二十三烷、二十五烷、二十七烷、二十九烷、9-辛基-二十烷、三十一烷、11-癸基二十一烷含量相对较高。

表1 DI-SPME方式萃取不同储藏周期小麦挥发性化合物定性结果

图1 DI-SPME萃取小麦挥发性物质的色谱图

采用HS-SPME-GC-MS技术，对不同储藏周期小麦样品的挥发性化合物提取分析，小麦样品挥发性物质的总离子流图(图2)。结合化合物匹配度、保留时间、保留指数等信息对数据进行鉴定，共定性出39种挥发性化合物成分，详见表2。主要挥发性成分为正己醛、庚醛、2-正戊基呋喃、2-乙基己醇、苯乙醛、壬醛、正壬醇、萘、正十二烷、正癸醛、十三烷、γ-壬内酯、十七(碳)烷、十七烷酮，其中正己醛相对含量随储藏周期的延长呈上升趋势，苯乙醛随储藏周期的延长呈下降趋势，其他部分主要挥发性成分随储藏周期的延长呈波动上升或下降趋势。

图2 HS-SPME萃取小麦挥发性物质的色谱图

表2 HS-SPME方式萃取不同储藏周期小麦挥发性化合物的定性结果

续表2

通过比对鉴定结果和色谱图，发现HS-SPME出峰时间集中在前期和中期，大部分以C10～C20化合物为主，属于中高挥发性化合物；DI-SPME出峰时间多在中期和后期，化合物碳数多集中在C20～C30范围内，属于中低挥发性化合物。2种萃取模式下共检测到酸类5种、醛类12种、醇类3种、烃类22种、酯类7种、酮类9种和其他3种。

2.2 锈赤扁谷盗侵染不同储藏周期小麦各类挥发性化合物的变化

锈赤扁谷盗侵染小麦样品的定性、定量检测结果显示，检测出的挥发性化合物类型主要为醛类、烃类、醇类、酯类、酸类和其他物质，详见表3。

表3 4周内锈赤扁谷盗侵染后小麦中各类挥发性化合物质量分数变化/%

储藏4周后，各类挥发性化合物相对含量的变化以及与空白对照组小麦相比变化幅度如图3所示。随储藏时间的延长，锈赤扁谷盗侵染后小麦醇类化合物相对含量呈上升趋势，主要由2-乙基己醇引起，呈柑橘香气，醇类化合物是小麦香气重要的化合物，通常具有花香、植物香；酮类、酯类化合物相对含量先上升后下降；烃类、醛类是6大类化合物中相对含量较高的化合物，呈现波动变化，变化不明显。酸类化合物随着虫口密度及储藏时间的增加，相对含量呈急剧上升的趋势，在锈赤扁谷盗侵染第3周达到最大值27.55%，约为空白对照小麦样品的9倍，其中γ-亚麻酸是锈赤扁谷盗侵染后才被检出，这说明侵染对小麦的脂类物质影响较大，可以初步作为判别小麦受锈赤扁谷盗侵染程度的标志物之一，仍需进一步研究验证。

图3 不同储藏期内被锈赤扁谷盗侵染后小麦各类挥发性化合物相对含量变化及变化倍数

2.3 不同虫口密度侵染后小麦样品挥发性化合物差异分析

2.3.1 主成分分析(PCA)

主成分分析(PCA)是一种无监督的分析模式，客观地根据变量信息，降维后对样品进行分类[22]。运用主成分分析并不能很好地区分不同处理组的小麦样品，样品间存在离散与重合现象，如图4所示，说明样品间挥发性化合物的组成及含量存在相似的可能，但不同储藏周期也造成了样品的组内差异。因此，PCA模型无法消除组内与研究目的无关的变量，不能很好地发现组间差异。

图4 不同虫口密度锈赤扁谷盗侵染小麦挥发性化合物PCA得分图

2.3.2 偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)

PLS-DA是一种有监督的分析模式，即在预知分类的条件下根据样品信息对训练样品集建立判别模型[23]。根据挥发性化合物组成和相对含量，对3个虫口密度的挥发性化合物进行PLS-DA分析，建立不同虫口密度判别分析模型，图5为PLS-DA得分图，即为各样品点在主成分1和主成分2构成的平面上的垂直投影得分值，图6为Hotelling T2分布图。

图5 不同虫口密度锈赤扁谷盗侵染小麦挥发性化合物PLS-DA得分图

注：a1～a4分别表示锈赤扁拟谷盗侵染，虫口密度为0的条件下储藏第1周、第2周、第3周、第4周；b1～b4分别表示锈赤扁拟谷盗侵染，虫口密度为10的条件下储藏第1周、第2周、第3周、第4周；c1～c4分别表示锈赤扁拟谷盗侵染，虫口密度为100的条件下储藏第1周、第2周、第3周、第4周。图8亦同。图6 Hotelling T2分布图

图7PLS-DA模型置换验证图

由图5和图6可知，36个样品的相似度均在95%的置信区间内，不同虫口密度侵染后小麦样品存在聚类趋势，未发现离群样品点，说明建立的PLS-DA模型可以对36个样品进行判别分析。运用PLS-DA模型分析过程中共得到7个主成分，建立的模型可以将3个虫口密度明显区分(图5所示)。结果表明，本研究建立的PLS-DA模型有良好的拟合参数；R2(X)=0.89，R2(X)越接近1，模型越稳定；R2(Y)=0.982，R2(Y)越大，模型的解释能力越强，说明该模型可以解释98.2%的原始数据；Q2=0.922大于0.5，说明模型的预测性好[24]。

2.3.3 PLS-DA模型的可靠性验证

分别对3个虫口密度的判别模型进行20次置换后验证，结果如图7所示。3个模型Q2的一元线性回归曲线在纵轴上的截距均小于0，说明3个模型均不存在过拟合现象，模型可靠，可用于不同虫口密度侵染后小麦样品的判别分析。

2.3.4 不同虫口密度侵染后小麦样品差异挥发性化合物判别分析

以挥发性化合物的变量投影重要性(VIP)值为指标，考虑不同虫口密度侵染后小麦样品的数据特征，量化PLS-DA模型的每个变量对判别的贡献。VIP值越大，该挥发性化合物在不同虫口密度侵染后小麦样品之间的差异越大，越对分类起着关键的作用。通常认为VIP值大于1的变量在不同类别之间差异显著，本实验筛选到17种差异挥发性化合物。

使用SPSS 22.0对17种差异挥发性化合物数据进行Kruskal Wallis检验。基于VIP值(VIP>1)、P值(P<0.05)，进一步筛选出9种关键差异挥发性化合物，详见表4。

表4 PLS-DA模型中VIP值大于1的化合物P值及其萃取方式

2.4 不同虫口密度侵染后小麦差异挥发性化合物层次聚类

对筛选出的9种差异挥发性化合物进行层次聚类分析，虫口密度为 0、10和 100的锈赤扁谷盗侵染的小麦挥发性化合物的变化以热力图形式呈现(图8)，其中横轴为不同虫口密度处理的实验分组，纵轴代表各处理组筛选后的差异挥发性化合物，区块颜色的深浅表示挥发性化合物含量的高低(红色表示含量高，蓝色表示含量低)。

图8分为三部分，第一部分是左侧12列，表示未被锈赤扁谷盗侵染的小麦样品即侵染虫口密度为0 时的小麦样品(WCF-CK)；第二部分是中部12列，表示被 10头锈赤扁谷盗侵染后的小麦样品(WCF-10)；第三部分为右侧12列，表示被 100头锈赤扁谷盗侵染的小麦样品(WCF-100)。通过颜色分布可知，最右侧区域即被100头锈赤扁谷盗侵染后的小麦差异挥发性化合物样品中红色或橘红色区域较多，这与差异挥发性化合物含量增加的鉴定结果相符合；中间区域较右侧区域颜色略浅，红色或橘红色区域在底部有明显聚集，对应的挥发性化合物为2-十九烷酮、二十九烷；其他区域中，左侧部分颜色整体最浅，但其中也夹杂有橘红色的高含量化合物，比如最顶部红色区域，对应的挥发性化合物为γ-己内酯，是空白对照组的标志化合物，与挥发性化合物鉴定结果相符合。这说明外界条件的改变会显著影响到每个样品差异挥发性化合物的表达量。图8表明随着锈赤扁谷盗侵染数量的上升，小麦特征挥发性化合物随之发生变化，在侵染小麦一周后，锈赤扁谷盗侵染后不同小麦样品间的差异便体现出来，印证了所筛选出的小麦差异挥发性化合物可以作为标志化合物，以体现出各样品间的差异性。

图8 9种差异挥发性化合物层次聚类热力图

3 结论

通过SPME-GC-MS对不同虫口密度锈赤扁谷盗侵染及不同储藏周期的小麦自身挥发性化合物动态变化进行分析，探究了在小麦储藏期间内不同虫口密度锈赤扁谷盗侵染对小麦挥发性化合物的影响，通过监测关键差异挥发性化合物含量来判别小麦受锈赤扁谷盗侵染程度。结果表明，WCF-CK、WCF-10、WCF-100 3组样品在两种固相萃取模式下共定性、定量检测出61种挥发性化合物，其中HS-SPME共富集到40种挥发性化合物，DI-SPME富集到21种挥发性化合物。基于挥发性化合物，运用PLS-DA可以实现良好分离，其中R2(Y)=0.982,Q2=0.922说明该模型具有良好的稳定性和预测性。PLS-DA得到VIP值，筛选到9种差异挥发性化合物，为γ-亚麻酸、2-十九烷酮、γ-己内酯、十七烷酮、二十九烷、二十七烷、二十七烷醇、1-碘-2-甲基十一烷、壬醛，说明锈赤扁谷盗的侵染可能会干扰储藏过程中小麦的代谢机制，影响其挥发性化合物的形成；层次聚类分析表明差异性挥发性化合物作为标志化合物可以体现出各样品间的差异性，因此，储藏周期及虫口密度对小麦挥发性化合物的表达量会产生显著影响。