麦麸阿魏酸低聚糖酯组分的结构表征及其对美拉德反应产物抑制作用研究

赵文红 冯丽然 关二旗

(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001)

谷物皮层含有多种具有抗氧化活性的酚类物质[1]，并且主要以结合态的形式存在[2]，具代表性的是麸皮中的阿魏酸低聚糖酯(Feruloylated Oligosaccharides，FOs)(图1)。基于其结合态酚酸结构特征，FOs具有水溶性好、热稳定性高的优点[3]，在2010年被美国FDA批准其作为食品添加剂在焙烤食品、饮料等加工食品中使用。

已有研究报道阿魏酸(FA)能够通过清除自由基、直接或间接抑制反应产物生成等方式影响美拉德反应[4]。但是FOs作为新型的功能性添加剂对美拉德反应产物的影响研究鲜见报道。丙酮醛(MGO)、乙二醛(GO)和2, 3-丁二酮(2, 3-BD)是美拉德反应过程中产生的α-二羰基化合物，既是形成食品风味和色泽物质的重要中间物质[5]，同时作为糖基化剂，可参与美拉德反应晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成，对人体造成危害[6]。MGO和GO的半数细胞毒性浓度为300～1 000 μmol/L[7]，2, 3-BD引起乳糖不耐症和氧化应激等[8]。谷物皮层中的酚类物质活性受到单糖组成、酚酸含量、空间构型及溶解度等理化的影响[9,10]，需要明晰其结构才能更好的阐明其活性。因此，本研究即在结构表征麦麸FOs组分F3的基础上，研究其对模拟体系中美拉德反应产物的抑制作用，为高活性FOs组分的筛选与制备提供参考，促进谷物资源功能性因子的开发和应用。

(5-O-FA-α-L-Ara)-(1→3)-[O-β-D-Xyl]n图1 阿魏酸糖酯基本结构

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：麦麸；Amberlite XAD-2吸附树脂；Sephadex LH-20凝胶填料

试剂：阿魏酸、木糖和阿拉伯糖标准品；聚苯乙烯标准品；甘氨酸、邻苯二胺、葡萄糖、谷朊粉、乙二醛、丙醛酮、2, 3-丁二酮、邻苯二酚。甲醇、乙酸和乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 设备与仪器

RE-6000A 旋转蒸发器，LGJ-10C冷冻干燥机，UV-6300系列可见光光度计，ALPHA傅里叶红外光谱仪，7890气相色谱仪，1260 Infineity Ⅱ 高效液相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 F3的制备

F3的制备见文献[11]。收集合并第三个吸收峰对应的洗脱液，浓缩后冷冻干燥即得麦麸阿魏酸糖酯组分(F3)。

1.3.2 F3的紫外光谱分析

以阿魏酸标准品为对照，采用紫外可见分光光度计对1.3.1中组分F3样液(1 mg/mL)进行紫外全波长扫描(220～400 nm)及组分的定性鉴别。

1.3.3 F3的结构表征1.3.3.1 HPLC分析

F3经碱解处理后采用HPLC法检测并分析其酚酸组成[12]。改良实验操作为：取1 mL组分F3样液(1 mg/mL)与1 mL氢氧化钠溶液(0.4 mol/L)混匀后置于35 ℃的暗处碱解3 h；待冷却后，加入1.5 mL的H3PO4溶液(0.4 mol/L)终止该反应；碱解液经0.45 μm有机滤膜过滤后，以阿魏酸标准品为对照进行HPLC检测。

HPLC检测采用C18 inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；V(甲醇)∶V(1%醋酸溶液)=0.30∶0.70的流动相；设定流速为1.0 mL/min；检测波长320 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3.2 GC分析

参考Yu[13]的方法，1.3.1中组分F3制成三氟乙酸溶液(2 mol/L)置于120 ℃油浴保温水解2 h；后经旋转蒸发干燥后加入50 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，混合后置于90 ℃水浴中反应15 min；再加入0.5 mL乙酸酐继续于90 ℃保温20 min；反应完成后旋转蒸发干燥即得组分F3水解成分乙酰化衍生物。该衍生物以三氯甲烷溶解后，以木糖和阿拉伯糖标准品为对照进行GC检测与分析。

GC检测采用HP-5毛细管柱(30 m×320 μm×250 μm)；载气流速：氢气40 mL/min，空气450 mL/min，氮气25 mL/min；柱温：100 ℃；进样口温度：200 ℃；检测器：FID；检测器温度：250 ℃；进样量：1.0 μL。程序升温。

1.3.3.3 IR分析

取1.3.1步骤中1 mg组分F3置于玛瑙研钵中，加入100 mg KBr混匀；研磨混合粉末后置于压模器，加压制得膜片后在500～4 000 cm-1扫描范围内进行IR检测与分析。

1.3.3.4 平均相对分子质量的分析

用1.0 mL四氢呋喃溶解不同分子质量的聚苯乙烯标准品(分子质量分别为210、580、850、1 300、1 780 u)，加入25%乙醇水配制成2.0 mg/mL的标准溶液；采用Sephadex LH-20色谱层析柱，以V(四氢呋喃)∶V(25%乙醇水)=1∶10的流动相在0.5 mL/min的流速下，测得不同分子质量聚苯乙烯标准品的洗脱图谱；以分子质量为纵坐标，保留时间为横坐标，绘制并得到分子质量-保留时间标准曲线及其方程。

将F3样品(6 mL)上样于同一个Sephadex LH-20色谱层析柱；在相同条件下洗脱得到其洗脱图谱；读取其相应的保留时间，依照上述方程计算得到该组分的平均相对分子质量，并结合其GC、HPLC和IR结构表征结果解析其组成。

1.3.4 F3对美拉德反应模拟体系中间产物的影响1.3.4.1 α-二羰基化合物标准曲线的绘制

参考吴泰钢等[14]方法，分别取2.0 mL浓度为2、4、10、20、40、100 μg/mL的MGO、GO和2, 3-BD溶液，加入2.0 mL邻苯二酚(0.6%)后置于60 ℃水浴锅中反应4 h进行衍生化处理，反应结束后反应液过0.45 μm有机滤膜，进HPLC检测分析。

HPLC检测条件为：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)色谱柱；V(乙腈)∶V(0.1%醋酸溶液)=0.30∶0.70流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长为315 nm；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。以样品浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制三种α-二羰基化合物标准曲线。

1.3.4.2 F3对α-二羰基化合物生成的影响测定

参考姚胜文[15]和黄启瑞[16]的方法经改良利用葡萄糖和谷朊粉构建美拉德反应体系。以0.1 mol/L柠檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液配制pH为8.0的缓冲溶液；准确称取7.0 g葡萄糖用pH 8.0的磷酸缓冲液溶解后定容至100 mL，配制为80 mg/mL的葡萄糖溶液；用pH 8.0的磷酸缓冲液配制F3溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F3溶液(50 mg/mL)加入缓冲液使终体积为1.0 mL；分别加入10 mL葡萄糖溶液和0.3 g谷朊粉，充分混匀后放入预升温至120 ℃的烘箱中反应60 min，之后在冰水浴中终止反应；反应液定容至15 mL，以5 000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL加入2.0 mL邻苯二酚，60 ℃水浴4 h进行衍生处理；反应结束后过0.45 μm有机滤膜进行HPLC检测(检测条件同前)。以FA为对照，依据相应的α-二羰基化合物的标准曲线计算得出相应浓度，并按照以下公式计算F3对α-二羰基化合物的抑制率：

式中：C0为反应混合物中不含F3或FA时α-二羰基化合物的浓度/μg/mL；C1为反应混合物中含有F3或FA时α-二羰基化合物的浓度/μg/mL。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 F3的定性鉴别

F3和FA经紫外全波长扫描图谱见图2。Jankovska等[17]的研究认为，与游离阿魏酸中苯环的特征吸收位置相比，酯化阿魏酸的吸收会出现一定程度的红移。由图2结果可见，F3在325 nm左右出现最大吸收峰，与FA在310 nm处的吸收相比出现吸收红移现象。该研究结果与前人研究一致。紫外全波长扫描图谱结果表明，F3结构中可能含有酯化酚酸结构，即F3为结合型谷物酚类物质。

图2 Sephadex LH-20凝胶柱洗脱组分F3和FA的紫外全波长扫描图谱

2.2 F3的结构分析

2.2.1 F3中的酚酸成分

酯化酚酸经碱水解后经HPLC法检测可鉴别其结构中含有的酚酸成分，结果见图3。F3经碱解处理后在16.380 min和19.051 min处出现检出峰(图3a)；与FA标准品的HPLC出峰时间16.362 min(反式FA)和19.066 min(顺式FA)相近(图3b)。结果表明：F3中的酚酸成分为阿魏酸。

图3 F3碱水解(a)及阿魏酸标品(b)的HPLC图谱

2.2.2 F3中的单糖组成

F3水解产物经GC检测可分析其单糖组成，结果见图4。GC结果可知：F3中主要在16.536 min和16.965 min处出峰(图4a)；与阿拉伯糖的保留时间16.776 min(图4b)、木糖(图4c)的保留时间17.150 min相近。结果表明：组分F3结构中糖体部分由阿拉伯糖和木糖组成。经计算，其中阿拉伯糖和木糖物质的摩尔比为1∶2.91。

图4 F3(a)、阿拉伯糖(b)及木糖(c)的GC图谱

2.2.3 F3的基团结构

红外光谱法可测定物质的基团结构。F3的红外光谱扫描图谱见图5。在3 400 cm-1左右处出现O—H的伸缩振动；2 920 cm-1左右出现C—H伸缩振动；1 200～1 400 cm-1处出现C—H的变角振动，这些区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰[18]。该结构经2.2.2中GC分析证实为阿拉伯糖和木糖。

图5 F3的红外光谱图

此外，1 656～1 500 cm-1之间吸收峰的存在证明了组分中苯环的存在，该结果已经在2.1步骤中实验验证；而在1 728 cm-1附近的吸收峰显示为酯键的特征吸收峰(1 722 cm-1)；另外，896 cm-1左右的吸收峰表现为β (1-4)吡喃糖糖苷键的特征峰[19]。IR分析结果表明，F3为含有β (1-4)吡喃糖糖苷键的糖酯类化合物。结合2.2.1中研究结果可知，F3为阿魏酸通过酯键连接在阿拉伯木糖糖体上的糖酯结构。

2.3 F3的组成分析

不同分子质量聚苯乙烯标准品的Sephadex LH-20凝胶柱洗脱图谱见图6。在该实验条件下二者的回归方程为y=-712.1ln(x)+4 484.5，该模型中聚苯乙烯分子质量与保留时间具有良好的拟合度，R2达到了0.989 8。F3在此色谱条件下的出峰时间为(181±3.5) min，根据回归方程计算可知该样品的平均相对分子质量为(781.429±13.774) u。

图6 聚苯乙烯标准品的Sephadex LH-20凝胶柱洗脱图谱

据2.2.2中GC法检测F3中阿拉伯糖和木糖的摩尔比为1∶2.91，推测其可能的分子式为FA-ara-(xly)3，经计算该组分的分子质量为789.709 u。该结果在Sephadex LH-20凝胶色谱法拟合的组分F3平均相对分子质量范围(781.429±13.774) u。结果表明，麦麸组分F3为结合态谷物酚类物质，阿魏酰阿拉伯糖基木三糖(FA-ara-(xly)3)，该结果与前人研究一致[20]。

2.4 F3对模拟体系中美拉德反应中间产物生成的影响

2.4.1 α-二羰基化合物的检测

美拉德反应产物α-二羰基化合物经邻苯二胺衍生化生成喹喔啉可利用HPLC法检测。三种α-二羰基化合物的HPLC图谱及线性回归关系参数见图7，在2.082 min左右的峰为邻苯二酚的特征峰，MGO、GO和2,3-BD的出峰时间分别为5.068 min、4.277 min和6.247 min。此外，三种α-二羰基化合物标准曲线的线性关系良好，在2～100 μg/mL范围内，三个线性回归方程分别为y=17.516 2x-3.408 1、y=30.066 9x+5.146 8、y=21.816 0x-1.301 6,R2均在0.999 9以上，最低检测限为10 ng/mL。因此，可进行组分F3对模拟体系中的3种美拉德反应产物α-二羰基化合物的影响研究。

图7三种α-二羰基化合物的HPLC图谱

2.4.2 麦麸阿魏酸糖酯组分F3抑制美拉德反应中间产物α-二羰基化合物

以FA为对照，研究F3对美拉德反应中间产物α-二羰基化合物的影响，结果见图8，以及当质量浓度为50 mg/mL时，F3和FA对3种α-二羰基化合物的抑制作用比较，结果见表1。

图8 F3对α-二羰基化合物MGO、GO、2,3-BD的抑制作用

表1 F3和FA对3种α-二羰基化合物抑制作用的比较

由图8可见，F3和FA对美拉德反应产物MGO、GO和2, 3-BD这3种α-二羰基化合物的生成抑制效果顺序为：2, 3-BD>GO>MGO，其抑制率随着浓度的增加呈上升趋势。由表1可知，当浓度为50 mg/mL时，F3对这3种α-二羰基化合物的抑制率分别为(81.46±4.69)%、(68.24±0.16)%和(54.89±2.25)%，均显著优于FA的(64.85±2.92)%、(57.18±1.52)%和(33.49±1.57)%(P<0.05)。在美拉德反应过程中，糖分子的碳链裂解会形成α-二羰基化合物，该过程中会有羰自由基、羟自由基等的生成。而组分F3可能受糖酯结构对单电子转移的影响[21]和糖羟基含量的综合影响，因此对模拟体系美拉德反应中间产物的生成具有良好的抑制作用。此外，由于2, 3-BD的毒性较强，因此研究F3和FA对2, 3-BD的抑制作用更具有现实意义。

3 结论

本研究经Sephadex LH-20柱分离获得F3组分，其表现为结合态谷物酚的特征吸收，与游离酚酸相比其最大吸收峰红移；该组分为阿魏酸通过酯键连接在阿拉伯木糖糖体上的糖酯结构；相对平均分子质量为(781.429±13.774)u，其分子组成可能为FA-ara-(xly)3，即阿魏酰阿拉伯糖基木三糖。

通过构建食品美拉德反应体系，研究可见，F3和FA在葡萄糖-谷朊粉美拉德反应体系中均能够很好的抑制美拉德反应中间产物—3种α-二羰基化合物的产生，并且其抑制作用呈浓度依赖关系；其抑制效果顺序为：2, 3-BD>GO>MGO，当浓度为50 mg/mL时，F3对这3种α-二羰基化合物的抑制率分别为(81.46±4.69)%、(68.24±0.16)%和(54.89±2.25)%。因而F3对美拉德反应产物具有良好的抑制作用，但其抑制机制尚需进一步研究。