基于高效液相色谱特征图谱和一测多评法的淫羊藿配方颗粒质量标准研究

刘晓霞，丁青，陈芳，梁月仪，魏梅，孙冬梅，田维忠，霍文杰，李振雨*（1.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；2.广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244；.中国中药控股有限公司，广东 佛山 5280）

中药配方颗粒作为临床饮片的补充，具有安全、卫生、便于随身携带、方便调剂使用等优势，是中药饮片剂型改革的主要方向[1]。截止目前中药配方颗粒尚没有正式出台统一的国家标准，因此，市场流通的中药配方颗粒规格不统一，质量的参差不齐导致临床使用疗效难以保证，也为市场监管带来一定难度。

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥叶[2]，是临床常用的补阳药。现代化学和药理学研究表明，淫羊藿含有黄酮、酚苷、多糖和生物碱等多种有效成分，其中代表性的有效成分有淫羊藿苷，朝藿定A、B、C，宝藿苷Ⅰ等[3]，具有一定的骨细胞诱导潜能[4]，能够促进成骨细胞和骨髓基质细胞的增殖[5]，抑制肿瘤细胞表达、阻止骨细胞钙化的功能[6]。由于中药有效成分的多样性及复杂性，单一成分定量的化学药品质量控制模式既缺乏专属性，又难以反映中药内在质量，中药指纹/特征图谱能够提供更为全面、丰富的信息，因此常用于中药的质量控制研究。一测多评模式借助相对校正因子，只需测定一个成分（内参物），实现对多个有效成分的定量分析，解决了对照品难以获得的难题，在中药的质量控制方面应用越来越广泛[7-9]。本研究将淫羊藿配方颗粒特征图谱与一测多评模式相结合，从定性定量两个方面来评价淫羊藿配方颗粒的质量，为淫羊藿配方颗粒质量标准的制订提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪（e2695，沃特世公司），Thermo 高效液相色谱仪（U3000，赛默飞公司），Agilent 高效液相色谱仪（1260，安捷伦公司），Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（安捷伦公司），Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（赛默飞公司），Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（沃特世公司），万分之一分析电子天平（ME204E）、百万分之一分析电子天平（XP26，梅特勒-托利多公司），电子天平（JJ600，常熟市双杰测试仪器厂），数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司），恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司），超纯水系统（Milli-Q Direct，默克股份有限公司）。

1.2 试药

乙腈（默克股份有限公司，色谱纯），水为超纯水（实验室自制），其余试剂皆为分析纯。朝藿定A 对照品（批号：150520，含量：99.4%）、朝藿定B 对照品（批号：150518，含量：99.24%）（成都普菲德生物股份有限公司）；朝藿定C 对照品（批号：111780-201503，含量：100%）、淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516，含量：94.2%）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：111852-201603，含量：99.9%）（中国食品药品检定研究院）；12 批淫羊藿配方颗粒[广东一方制药有限公司生产，批号：YYH01～YYH12，规格：0.5 g/袋（相当于常规饮片10 g）]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱（0～30 min，24%～26%A；30～31 min，26%～45%A；31～45 min，45%～47%A）；流速为1.0 mL·min－1；柱温为30℃；检测波长为270 nm；进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定朝藿定A、B、C 对照品和淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含朝藿定A 17.201 μg、朝藿定B 36.938 μg、朝藿定C 48.270 μg、淫羊藿苷99.890 μg 的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取淫羊藿配方颗粒样品适量，研细，取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取淫羊藿配方颗粒（批号：YYH11）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，以淫羊藿苷色谱峰为参照峰S，计算其余特征峰的相对保留时间RSD值均不超过0.7%，相对峰面积RSD值均不超过0.11%，说明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批淫羊藿配方颗粒（批号：YYH11），按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以淫羊藿苷色谱峰为参照峰S，计算其余特征峰的相对保留时间RSD值均不超过0.12%，相对峰面积RSD值均不超过0.14%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取淫羊藿配方颗粒（批号：YYH11）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、14、19 和24 h 进样测定，以淫羊藿苷峰为参照峰S，计算其余特征峰的相对保留时间RSD值均不超过0.18%，相对峰面积RSD值均不超过0.29%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 淫羊藿配方颗粒特征图谱的建立

取12 批淫羊藿配方颗粒供试品溶液（批号：YYH01～YYH12），按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各批次样品的特征图谱，并导出CDF格式，将12 批淫羊藿配方颗粒特征图谱CDF 格式导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，以YYH01 的特征图谱为参照，对12 批淫羊藿配方颗粒特征图谱进行共有峰标识，并进行保留时间校正和峰匹配（见图1），选择出峰稳定，峰形和分离度较好的7 个共有峰作为淫羊藿配方颗粒的特征峰，建立淫羊藿配方颗粒特征图谱共有模式（见图2），参考相关文献[10]，通过对照品的保留时间比对并结合3D 光谱分析确定峰2 为朝藿定A，峰3 为朝藿定B，峰4 为朝藿定C，峰5 为淫羊藿苷，峰7 为宝藿苷Ⅰ，见图3。以淫羊藿配方颗粒特征图谱共有模式为参照，计算各样品特征图谱的相似度均大于0.9（见表1），说明12 批淫羊藿配方颗粒特征图谱的整体相似度较高，质量较稳定。

表1 12 批淫羊藿配方颗粒特征图谱相似度Tab 1 Similarity of specific chromatogram of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules

图1 12 批淫羊藿配方颗粒HPLC 特征图谱Fig 1 HPLC specific chromatogram of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules

图2 淫羊藿配方颗粒HPLC 特征图谱共有模式Fig 2 Common pattern of HPLC specific chromatograms of Herba epimedii dispensing granules

图3 淫羊藿配方颗粒特征图谱Fig 3 Chromatogram of Herba epimedii dispensing granules

2.6 总黄酮醇苷一测多评含量测定

2.6.1 线性关系考察 精密称定对照品朝藿定A 4.883 mg、朝藿定B 4.643 mg、朝藿定C 10.001 mg、淫羊藿苷10.573 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含朝藿定A 485.370 μg、朝藿定B 460.771 μg、朝藿定C 1000.100 μg、淫羊藿苷995.977 μg 的混合对照品储备液。精密移取上述混合对照品储备液0.5、0.5、0.5、1、2、3 mL，分别置100、25、5、5、5、5 mL 的量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，制成系列浓度的混合对照品溶液液，精密吸取上述混合对照品储备液和系列浓度的混合对照品溶液各10 μL，分别按“2.1”项下色谱条件进样分析，以色谱峰面积响应值为纵坐标（y），相应的对照品质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得到的回归方程及线性范围见表2。

表2 4 种成分的线性回归方程及线性范围Tab 2 Linear regression equation and linearity of 4 components

2.6.2 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱方法连续进样6 次，计算朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的峰面积RSD值分别为1.1%、0.33%、0.41%和0.39%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、3、6、14、19、24 h 测定，结果朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的峰面积RSD值分别为0.51%、0.30%、0.37%和0.33%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取淫羊藿配方颗粒供试品（批号：YYH02）溶液6 份，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以干燥品计，朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的含量分别为6.76、14.00、18.73、37.95 mg·g－1，RSD值分别为1.5%、0.81%、0.93%和0.69%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收试验 取淫羊藿配方颗粒（批号：YYH02）适量，研细，取约0.125 g，精密称定，按样品与对照品（朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷）的含量比为1∶0.5、1∶1 及1∶1.5 的比例加入朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷对照品，每种比例平行3 份，按“2.3”项下方法制备9 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的加样回收率分别在95.84%～99.78%、95.49%～101.62%、95.17%～101.41%、95.07%～99.92%，RSD值均小于2.0%，表明该分析方法准确度良好。

2.6.6 相对校正因子计算 根据“2.6.1”项下线性考察结果，以对照品的浓度及其对应的色谱峰面积，计算内标物淫羊藿苷与朝藿定A、B、C的相对校正因子[11]。朝藿定A、B、C 的平均相对校正因子分别为1.35、1.26 和1.24，RSD值分别为0.43%、1.1%和1.2%。

2.6.7 耐用性考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别考察Waters ARC、ThermoU3000、Agilent 1260 infinity 3 种高效液相色谱仪和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 种不同色谱柱，以及不同柱温和流速对朝藿定A、B、C 的相对校正因子以及各色谱峰分离度的影响。结果表明，不同色谱仪、色谱柱、柱温及流速下测定的朝藿定A、B、C 的相对校正因子RSD值均小于2.0%，且各色谱峰的分离度均大于1.5，表明该方法耐用性较好。

2.6.8 色谱峰定位 根据“2.6.7”项下耐用性考察结果，以淫羊藿苷峰为参照峰，分别计算Waters ARC、Thermo U3000、Agilent 1260 infinity 3 种高效液相色谱仪和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 种不同色谱柱，以及不同柱温和流速对朝藿定A、B、C 相对于参照峰的相对保留时间值。结果显示，不同的仪器、色谱柱、柱温和流速对朝藿定A、B、C 的相对保留时间影响较小，RSD均小于5.0%，因此，可以采用相对保留时间作为色谱峰定位的依据，朝藿定A、B、C 的相对保留时间值取不同仪器、色谱柱、柱温和流速下相对保留时间的均值，分别是0.71、0.79 和0.88。

2.6.9 QAMS 与EMS 比较 取12 批淫羊藿配方颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别采用外标法（ESM）和QAMS 计算12 批淫羊藿配方颗粒中朝藿定A、B、C 的含量，并计算两种测定法的相对平均偏差（RAD）（见表3），结果显示，两种方法测定的朝藿定A、B、C 的RAD 均小于1.0%，说明两种方法计算结果一致，一测多评法能准确测定4 种成分的含量。12 批淫羊藿配方颗粒淫羊藿苷的含量均大于20 mg·g－1，12 批淫羊藿配方颗粒总黄酮醇苷的含量在46.73～88.94 mg·g－1。

表3 12 批淫羊藿配方颗粒含量测定结果(以干燥品计，mg·g－1)Tab 3 Determination of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules (mg·g－1)

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备

以“特征图谱总峰面积/称样量”及总黄酮醇苷的含量为指标，系统考察了提取溶剂（不同比例的甲醇-水、乙醇-水、甲醇和乙醇）、提取方式（超声和回流两种不同方式）和提取时间（15、30、45、60 min）对淫羊藿配方颗粒特征图谱及含量测定的影响，结果显示，以75%乙醇50 mL超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min 效果最佳。

3.2 特征图谱和一测多评研究

对12 批淫羊藿配方颗粒特征图谱研究，确定了7 个共有特征峰，指认了其中5 个，各特征峰的相对保留时间一致性较好，相对峰面积差异较大，但指纹图谱的整体，相似度较高，都大于0.9。含量测定结果显示，4 种成分的含量在不同批次样品间相差较大，可能与原料的来源和生产工艺的不同有关；外标法与一测多评法所得结果无明显差异，表明本研究建立的一测多评法能够代替外标法对淫羊藿配方颗粒进行质量控制。

4 小结

中药化学成分繁多，单一成分难以准确评价配方颗粒的质量，一测多评法是多指标质量控制方法之一，将一测多评法与指纹/特征图谱法相结合，从定性、定量两个方面来评价淫羊藿配方颗粒的质量，该方法快速准确，简便高效，专属性良好，为淫羊藿配方颗粒的质量控制提供参考。