TRPC6介导的钙离子紊乱通过激活STAT3促进肾小管上皮细胞损伤后炎症反应及肾间质纤维化*

练飞鸿， 付 荣， 王雯倩， 彭 璇△

（1广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405；2广州医科大学附属第二医院，广东广州510260）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的发病率逐年升高，已成为全世界重要的公共卫生问题，而肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的主要病理基础和最终结局。RIF的机制错综复杂，涉及到多细胞、多因素、多途径的共同作用及交互影响［1-2］。研究表明，肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells，TECs）在致病因素的作用下极易受到损伤，发生结构及功能的异常。受损的TECs停滞于细胞周期G2/M期，合成、释放大量的炎症因子及促纤维化因子，加强免疫细胞迁移和浸润，使炎症反应持续放大。释放的细胞因子可正反馈作用于TECs自身，促进肾小管上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和TECs的继发性损伤，促进肾脏的炎症反应及肾间质成纤维细胞的活化。此外，受损的TECs存在代谢紊乱、线粒体功能受损，进而导致活性氧类释放增多，促进纤维化的发生发展［3-7］。

钙离子（Ca2+）是细胞内重要的第二信使，参与了细胞收缩舒张、增殖分化、递质释放及死亡等多种生命活动的调节。在真核生物体内，细胞通过一系列复杂而严密的机制对Ca2+浓度进行调控。其中，钙池操控性钙通道（store-operated calcium channel，SOC）是调节非兴奋细胞内Ca2+浓度的主要通道，保证信号的正常传递。瞬时受体电位阳离子通道C亚族（tran⁃sient receptor potential cation channel subfamily C，TRPC）是构成细胞膜上SOC的分子基础，该家族包括了TRPC1~7共7个成员，而越来越多的研究显示TRPC6参与了多种疾病的发生发展，其机制可能由于TRPC6基因启动子区域含有活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）反应元件，参与细胞内Ca2+浓度的持续增高，导致细胞内Ca2+紊乱，进而引起下游疾病相关靶基因的活化［8］。

近年来，越来越多的研究证实TRPC6与肾小球疾病的发病密切相关，足细胞TRPC6基因突变与家族性局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glor⁃nurular sclerosis，FSGS）相关，同时带有该突变基因的患者较快进展至终末期肾病，尽管其机制尚不明确，但一定程度上提示我们可能与TRPC6介导的细胞内Ca2+紊乱相关［9］。既往对TRPC6介导Ca2+的研究多集中于肾小球病变上，其对小管间质损伤的作用及调控机制还所知甚少。

信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路活化参与了细胞多种病理生理过程。作为STAT家族的重要成员，STAT3的活化在细胞增殖、迁移、分化以及炎症/免疫反应疾病的发病过程发挥重要作用。既往研究证实，STAT3磷酸化与肿瘤以及组织纤维化所致的慢性疾病密切相关，参与了肾间质纤维化的启动和维持［10-12］。

本研究利用药物抑制TRPC6介导的Ca2+内流，建立小鼠单侧输尿管梗阻（unilateral ureteric obstruc⁃tion，UUO）［13］模型，观察原代TECs内Ca2+浓度变化及肾小管损伤程度、肾组织炎症细胞浸润、炎症因子水平及肾脏纤维化情况。体外实验通过上调/沉默HK-2细胞TRPC6，研究TGF-β刺激下TECs炎症因子的表达和细胞外基质的合成，探讨其在TECs损伤后炎症反应中的作用及机制。

材料和方法

1 实验动物及实验细胞

雄性SPF级C57BL/6小鼠，8周龄，体重22~25 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号为SCXK（粤）2013-0034。所有实验动物均于广州医科大学附属第二医院SPF级实验动物房饲养和繁殖，所有研究工作均遵循广州医科大学《实验动物管理及使用指南》，并由广州医科大学实验动物管理委员会批准（审查编号B2019-050）。HK-2细胞（人肾脏近曲小管上皮细胞）购于ATCC。

2 主要试剂

BTP2和BATPA（Sigma）；抗TRPC6、STAT3和p-STAT3Ⅰ抗（Abcam）；抗COL1Ⅰ抗（Cell Signaling Technology）；抗β-actinⅠ抗（Invitrogen）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（Invitrogen）；封闭牛奶和loading buffer（Bio-Rad）；PVDF膜（Millipone）；Fluo-4 AM（Thermo Fisher Scientific）。

3 主要方法

3.1 小鼠UUO模型的建立 UUO为经典的肾脏纤维化模型，可以在较短时间内导致动物梗阻测肾脏发生肾间质纤维化。本研究选择体重位于22~25 g的雄性C57BL/6小鼠24只，8周龄，随机分为4组：假手术+溶媒组（sham+vehicle），sham+BTP2组，UUO+vehicle组和UUO+BTP2组，每组6只。以1%戊巴比妥麻醉小鼠，仰卧位固定于小鼠板，对小鼠腹部进行消毒，切开左侧腹部暴露并分离左侧输尿管，以丝线靠近肾门端及靠近膀胱端双结扎左侧输尿管，逐层缝合腹膜及皮肤。Sham组打开腹腔后不结扎输尿管，余操作与手术组相同。术后给予常规饲料及饮用水，于术后14 d以颈椎脱臼法处死小鼠，获取肾脏。一部分用于石蜡包埋及切片，行病理染色观察，另一部分置于液氮冷冻后转移至−80℃冰箱保存，用于组织蛋白及核酸的提取。

3.2 小鼠原代肾上皮细胞分离 将假手术组和UUO组小鼠断颈处死，无菌获取双肾，用0.01 mol/L PBS液反复冲洗双肾；去除肾包膜，用无菌剪刀将肾皮质剪碎，吸入15 mL离心管，加入PBS反复多次以清洗组织碎片；离心，去上清，向组织内加入溶解于钙镁平衡盐溶液中的0.25%胰蛋白酶，37℃振荡消化30 min；轻轻吹打分散组织；将组织碎片转移到100目无菌不锈钢丝网上充分研磨，收集液体至200目钢丝网过滤，离心10 min，弃上清，加入45%Per⁃coll分离液25 mL重悬细胞；4℃、28 347×g离心30 min，取近管底的F2层，即为分离纯化的近端肾小管细胞节段，用生理盐水离心洗涤2次，离心5 min，将细胞接种至培养皿中，置于细胞培养箱中培养，观察细胞形态，通过细胞免疫荧光观察细胞CK-18及E-cadherin表达，对肾小管上皮细胞进行鉴定。

3.3 细胞内Ca2+浓度测定 用钙的荧光指示剂Fluo-4/AM孵育细胞30 min；加入含有1%胎牛血清的HBSS孵育40 min后用HEPES液洗涤、重悬细胞，制成约1×108/L的溶液，37℃下培养10 min；于激光共聚焦显微镜专用皿中观察，按［Ca2+］i=Kd×（F−Fmin）/（Fmax−F）将荧光信号值换算成细胞内钙的浓度（nmol/L），其中37℃条件下的Kd值为450 nmol/L。

3.4 Western blot 取小鼠肾组织或HK-2细胞于RIPA裂解液中裂解，超声粉碎30 s；离心15 min后取上清液，使用Bradford蛋白定量法测定蛋白浓度。各样品配至终浓度为2 g/L，加入4×SDS上样缓冲液后沸水水浴使蛋白变性。总蛋白经SDS-PAGE分离、电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜，次日加入Ⅱ抗孵育，化学发光显影。

3.5 real-time PCR 通过基因库（GenBank；http：//www.ncbi.nlm.nkh.gov/pubmed/fulltext.htlm）获得PCR引物的基因序列，通过Primer Premier 5.0软件完成引物设计。反应条件为：95℃30 s；95℃15 s，60℃30 s，扩增40个循环。每个样品测3个复孔，分析样品的扩增曲线及熔解曲线，其中ΔCt=Ct目的基因−Ct内参照，ΔΔCt=ΔCt实验组−ΔCt对照组，计算出样品定量结果的平均值。

3.6 细胞培养及质粒转染 HK-2细胞在37℃无菌环境、5%CO2细胞培养箱中培养。使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。使用Lipofecta⁃mineTM2000进行TRPC6质粒及TRPC6siRNA转染，转染效率鉴定通过Western blot检测相应蛋白的表达实现。

4 统计学处理

SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准误（mean±SEM）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 梗阻型肾病模型中TECs内Ca2+浓度增加且伴随TRPC6表达升高

以C57BL/6小鼠为研究对象，建立UUO模型诱导肾脏纤维化，分离鉴定原代肾小管上皮细胞（图1A），使用激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+浓度的变化，如图1B所示，与对照组相比，UUO模型组TECs中Ca2+浓度显著增加。Western blot结果显示，与对照组相比，梗阻侧肾脏小管上皮细胞TRPC6表达水平增高，伴随COL1表达增多（P<0.05），见图1C。

2 TRPC6抑制剂减轻UUO模型小鼠肾脏炎症反应及纤维化水平

通过向小鼠腹腔注射BTP2抑制TRPC6通道的活性后观察其对肾脏炎症反应及肾间质纤维化的影响。HE染色结果显示，注射溶媒及BTP2的假手术组小鼠肾组织均未见显著异常；UUO模型小鼠中，注射溶媒后小鼠肾小管显著扩张，TECs细胞扁平，小管间质增宽，伴大量炎症细胞浸润，而注射BTP2则可减轻肾脏上述病理改变，见图2A。进一步检测了小鼠肾组织IL-1β、IL-6及TNF-α3种主要促炎因子的mRNA水平。Real-time PCR结果显示，与sham组相比，UUO模型组小鼠肾组织IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平显著升高（P<0.05），BTP2可抑制UUO模型小鼠肾组织IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达（P<0.05），见图2B。此外，Masson病理染色结果显示，与溶酶模型组比，BTP2干预减少了间质胶原沉积，减轻了肾间质纤维化程度，见图3A。Western blot结果亦显示，BTP2干预可降低肾组织COL1的蛋白水平，结果与染色结果类似，见图3B。

Figure 1.Increasing TECs Ca2+concentration in obstructive nephropathy model was accompanied by increased expression of TRPC6.A：mouse TECs were isolated and cultured and stained with CK-18 and E-cadherin（scale bar=20µm）；B：Ca2+concentra⁃tion was detected in mice primary TECs subjected to either sham operation or UUOoperation；C：kidney tissue lysates were subjected to immunoblot analysis for TRPC6 and COL1.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup.图1 梗阻性肾病模型中TECs中Ca2+浓度增加伴随TRPC6表达增多

Figure 2.Pharmalogical inhibition of TRPC6 reduced inflammation in UUOmodel mice.A：representative HEstaining images of kid⁃ney histology showed the morphologic injury and inflammatory cells infiltration and BTP2 injection reduced inflammation caused by obstraction（scale bar=20µm）；B：the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by realtime PCR.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group.图2 BTP2抑制TRPC6减轻UUO模型小鼠肾脏组织炎症反应

Figure 3.Drug inhibition of TRPC6 reduced renal interstitial fibrosis in UUO model mice.A：representative Masson staining images of kidney histology（scale bar=20µm）；B：Western blot analysis of proteins in different groups as indicated.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group.图3 BTP2抑制TRPC6减轻UUO模型小鼠肾间质纤维化

3 上调TRPC6加重TGF-β作用下HK-2细胞炎症反应及细胞外基质的合成

由于BTP2除了抑制TRPC6通道外，对其他SOC通道也存在一定作用，为了明确TRPC6对肾小管上皮细胞损伤后炎症反应及细胞外基质合成的影响，我们向HK-2细胞转染TRPC6质粒诱导其表达上调，如图4A，与空载体（vector）组相比，转染TRPC6质粒进一步加重了TGF-β刺激下小管上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的mRNA表 达（P<0.05）；Western blot结果显示，与空载体组相比，细胞转染TRPC6质粒后，TRPC6蛋白的表达增加，同时伴随COL1的表达水平升高，见图4B。

Figure 4.Overexpression of TRPC6 aggravated TGF-β-induced inflammatory response and extracellular matrix synthesis.A：HK-2 cells were transiently transfected with pcDNA3.1-TRPC6 or pcDNA3.1-HA（empty vector）and challenged with TGF-β，and the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by real-time PCR；B：cell lysates were analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs vector group；#P<0.05 vs TGF-β+vector group.图4 上调TRPC6加重TGF-β诱导的HK-2细胞炎症反应及细胞外基质的合成

4 沉默TRPC6抑制TGF-β诱导的HK-2细胞炎症反应及细胞外基质的合成

通过向HK-2细胞转染TRPC6siRNA抑制TRPC6表达，结果显示，在TGF-β刺激下，HK-2细胞炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA水平较转染scramble siRNA组下调（P<0.05），见图5A。Western blot结果显示，与scramble siRNA组相比，细胞转染TRPC6siRNA后，TRPC6蛋白的表达受到抑制，同时在TGF-β刺激下，HK-2细胞COL1的表达水平下降，见图5B。

Figure 5.Silencing of TRPC6 alleviated TGF-β-induced inflammation and extracellular matrix synthesis.A：the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by real-time PCR；B：the protein expression of TRPC6 and COL1 was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs scramble group；#P<0.05 vs TGF-β+scramble group.图5 沉默TRPC6减轻TGF-β诱导的HK-2细胞炎症反应及细胞外基质合成

5 沉默TRPC6减弱了TGF-β作用下HK-2细胞STAT3的活化

在UUO模型中检测到STAT信号通路的活化，表现为肾组织p-STAT3表达较sham组增多，而注射BTP2后，p-STAT3水平较溶媒组下降（P<0.05），见图6A。体外实验中，Western blot结果显示，TGF-β刺激下，肾小管上皮细胞STAT3磷酸化水平增加，细胞转染TRPC6siRNA后，STAT3磷酸化水平显著下降（P<0.05），见图6B。

6 高表达TRPC6进一步促进TGF-β作用下HK-2细胞STAT3活化

向HK-2细胞转染TRPC6质粒抑制后检测STAT信号通路活化的情况，结果显示，转染TRPC6质粒进一步促进HK-2细胞中TGF-β诱导的p-STAT3表达，而使用钙离子螯合剂BATPA后，p-STAT3表达被明显抑制，蛋白水平显著降低，见图7。

讨 论

肾间质纤维化的发病机制错综复杂，涉及到多因素、多细胞、多途径的作用，其特征表现为大量细胞外基质的异常沉积，造成肾实质的纤维化，最终导致肾功能的丧失［14］。在致病因素的作用下，肾脏发生炎症反应以清除病原体、修复组织损伤，但级联的炎症反应也是肾间质纤维化的始动因素。TECs是肾实质主要的固有细胞之一，正常情况下，TECs代谢旺盛，担负着重吸收与分泌的功能，具有潜在的增殖及再生能力。越来越多的研究表明，TECs不仅是肾脏病变过程中的“受害者”，更主动参与了肾脏纤维化的形成。受损的TECs停滞于细胞周期的G2/M期，合成、释放大量的炎症因子及促纤维化因子，这些细胞因子加强免疫细胞迁移和浸润，使炎症反应持续和放大，而释放的细胞因子可正反馈作用于TECs自身，促进EMT和TECs的继发性损伤，促进肾脏的炎症反应及肾间质成纤维细胞的活化［15］。我们的研究也显示，在UUO模型中，肾组织发生炎症反应，表现为大量炎症细胞的浸润以及炎症因子合成增多，伴随肾间质纤维化程度较假手术组显著加重。但病理状态下，TECs损伤后生物学行为改变和炎症反应发生发展的机制尚不清楚。

Ca2+是细胞内重要的第二信使，参与了细胞多种生命活动的调节。在真核生物体内，细胞内Ca2+浓度升高主要来源于细胞外钙内流和细胞内钙库的释放，而外钙内流途径主要通过受体门控性钙通道（re⁃ceptor-operated calcium channel，ROC）、电压门控钙通道（voltage-operated calcium channel，VOC）和SOC的调控。在受到相应刺激时，ROC和VOC通道开放，使大量Ca2+短时间内流入细胞内，而SOC则持续产生小量的钙内流，以保证信号的正常传递。TRPC是构成细胞膜上ROC和SOC的分子基础。而越来越多的研究显示TRPC6参与了心血管疾病、肿瘤、呼吸系统等多种疾病的发生发展［8，16-17］。

Figure 6.Inhibition of TRPC6 reduced renal tissue STAT3 activation.A：representative immunoblot analysis of STAT3 and p-STAT3 in UUOmouse kidney extracts；B：relative protein levels of p-STAT3 in HK-2 cells.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group；△P<0.05 vs scramble group；▲P<0.05 vs TGF-β+scramble group.图6 抑制TRPC6可抑制肾组织及HK-2细胞中STAT3活化

Figure 7.Overexpression of TRPC6 promoted STAT3 activation in HK-2 cells.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs TGF-β+vector group；#P<0.05 vs TGF-β+TRPC6 plasmid group.图7高表达TRPC6促进HK-2细胞STAT3活化

近年来，关于TRPC6与肾脏疾病的研究取得了显著进展，主要涉及足细胞。该基因突变可导致大量蛋白尿。人类全基因组关联研究从基因水平证明，足细胞Trpc6基因突变与家族性局灶节段性肾小球硬化症相关，同时带有该突变基因患者较快进展至终末期肾病［9］。血管紧张素Ⅱ诱导的高血压肾病模型中，TRPC6基因敲除小鼠蛋白尿显著减少，肾功能水平及肾脏病理改变水平显著优于野生型对照组，并且这种保护作用独立于血流动力的改变［18］。既往对TRPC6的研究多集中于肾小球病变上，其对小管间质损伤所致纤维化的作用及调控机制还所知甚少。我们分离UUO模型及假手术组小鼠原代TECs，显示UUO模型组TECs内Ca2+浓度较对照组显著升高，同时伴随TRPC6蛋白表达水平增高，而药物抑制TRPC6后肾间质炎症反应及纤维化程度得到改善。我们在体外实验中也得到相似的结果，表现为沉默TRPC6表达减轻TGF-β诱导的HK-2细胞的炎症反应及细胞外基质产生，而高表达TRPC6则加重上述反应，提示在损伤因素的作用下，TECs发生Ca2+紊乱，引起肾间质炎症反应及细胞外基质沉积，而Ca2+紊乱可能由TRPC6通道介导。

STAT蛋白家族与机体的炎症及免疫反应密切相关，其中STAT3作为一种转录因子参与调控多种炎症相关基因的表达，在细胞因子合成与释放过程中起着重要作用，参与多种免疫炎症性疾病的发生发展［19-21］。我们的研究观察到，在UUO模型小鼠肾组织中STAT3活化，表现为p-STAT3表达水平增高，同样，在细胞实验中也观察到类似的现象，而通过药物抑制或基因沉默TRPC6表达时，p-STAT3表达受到抑制，高表达TRPC6则促进p-STAT3的表达，而使用钙离子螯合剂处理HK-2细胞后，p-STAT3的表达受到抑制，提示TRPC6可能通过影响Ca2+水平调控TECs STAT3通路，从而促进肾脏炎症反应及肾间质纤维化的发生发展，

综上所述，在梗阻性肾病模型及体外应用TGF-β刺激下，TECs的TRPC6通道活化可引起细胞内Ca2+浓度升高，进一步激活STAT3通路，引起肾脏的炎症反应及肾间质纤维化。