Caspase-1介导的细胞焦亡对脑出血大鼠神经损伤的影响*

郭亚净， 任 静， 刘 寒， 李亭亭， 王 洪

（河北中医学院中西医结合学院，河北石家庄050200）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）具有很高的死亡率和致残率，占所有卒中类型的15%~20%，且其发病人数呈逐年上升趋势［1］。并且，大多数幸存者会遗留不同程度的神经功能障碍［2］。大量研究表明，血脑屏障破坏、脑水肿、炎症反应和凝血酶毒性效应等继发性脑损伤是导致神经功能障碍，造成不良预后的主要原因［3-4］。

胱天蛋白酶1（caspase-1）作为炎症性半胱天冬酶，介导细胞固有免疫炎症反应，促进白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等炎症因子的成熟与释放。同时，caspase-1还能使细胞焦亡执行蛋白gasdermin D（GSDMD）发生剪切，并在细胞膜聚集，造成细胞穿孔，引起细胞焦亡［5］。实验研究显示，caspase-1介导的炎症反应和细胞焦亡参与多种神经相关性疾病的发展过程［6-10］。然而，其在ICH后神经损伤中是否起作用仍不十分清楚。

本课题组利用自体非抗凝血注射法制造大鼠ICH模型，采用脑室内注射caspase-1选择性抑制剂Ac-YVAD-CMK的方法，观察caspase-1介导的细胞焦亡在ICH后神经损伤中的作用。

材料和方法

1 动物

SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，8~10周龄，体重约250~300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（京）2016-0006。饲养条件，温度恒定为（22±1）℃，湿度为（50±20）%，光照条件为昼夜各12 h，自由饮食、水。适应性饲养1周后，开始第1部分实验。将30只大鼠随机分为5组（每组6只大鼠）：假手术（sham）组、ICH 12 h组、ICH 24 h组、ICH 48 h组和ICH 72 h组。采用Western blot方法，观察caspase-1和GSDMD在ICH后的表达及激活情况，选取活化变化最明显的时间点。根据第1部分实验结果，采用同样的造模方式，开始第2部分实验：54只大鼠随机平均分为3组（每组18只大鼠）：sham组、ICH组和Ac-YVAD-CMK给药组（YVAD组），用于观察Ac-YVAD-CMK的作用。造模过程中未出现动物死亡情况，成功率为100%。动物实验程序通过河北中医学院实验动物伦理委员会批准（编号DWLL-2018005）。

2 主要试剂

Ac-YVAD-CMK购自APExBIO；BCA蛋白浓度测定试剂盒、神经元核抗原（neuronal nuclei，NeuN；神经元特异性核蛋白）抗体、离子钙结合接头分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1；小胶质细胞标志物）抗体和β-actin抗体购自Servicebio；ECL显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；caspase-1和GSDMD抗体购自Santa Cruz；IL-1β和IL-18抗体购自Abcam；辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗IgG购自Cell Signaling Technology；TUNEL试剂盒购自Roche；Fluoro-Jade C（FJC）染色剂购自Millipore。

3 主要方法

3.1 Ac-YVAD-CMK给药方法 给药方法参考已有文献［11］。将Ac-YVAD-CMK溶解于DMSO中，用PBS进一步稀释至浓度为1 g/L（DMSO终浓度<0.2%）待用。大鼠称重，1%戊巴比妥钠，100 mL/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉成功后，将其固定于全自动脑立体定位仪上（51700，Stoelting），剪去大鼠头顶毛发，碘伏消毒，剪开大鼠头部正中皮肤约1 cm×1 cm，轻轻擦拭掉颅骨表面筋膜及软组织，定位前囟，然后以前囟作为原点，向后1.0 mm、向右旁开1.5 mm标记为穿刺点，颅钻垂直向下钻开一个直径约1 mm的注射孔，将装有Ac-YVAD-CMK的微量注射器安装到电动注射装置上，垂直向下进针4.5 mm穿刺进入脑室后，以1µL/min的速度注入Ac-YVAD-CMK，每只大鼠注射1µL。注药完毕后留针3 min，再缓慢退针。sham组和ICH组操作方法同上，以等体积PBS稀释的DMSO注入侧脑室，不注入任何药物。

3.2 ICH模型的制备 侧脑室注射Ac-YVAD-CMK 20 min后，建立ICH模型。以前囟作为原点，向前0.12 mm、向右旁开3.8 mm标记为穿刺点，然后用颅钻垂直向下钻开直径约1 mm的注射孔。碘伏擦拭大鼠尾尖，剪断尾尖取血，迅速将100µL血液转移到微量注射器中，将微量注射器安装到电动注射装置上，垂直向下进针5.5 mm穿刺进入纹状体，以10µL/min的速度注入自体非抗凝血，注射结束后停针20 min，然后缓慢退针。最后用骨蜡封闭注射孔，并用手术线缝合切口。

3.3 神经功能评价 （1）前肢放置实验用于评价大鼠的感觉运动功能：测试者握住大鼠背部皮肤使四肢悬空，将大鼠胡须接触桌面边缘诱导其将前肢放置于桌面上，纹状体受损大鼠，其受损对侧肢体将出现不同程度的放置能力缺失。大鼠每侧受测10次，左侧前肢成功放置的百分率反应损伤情况。（2）转角实验用于评价大鼠肢体协调功能：将大鼠放入一个两块板所形成的30°夹角内，使其转身，观察并记录大鼠向左侧转身的次数。每只大鼠重复放置10次，每次间隔至少30 s，左侧转身次数百分率反应损伤情况。（3）改良神经功能缺损评分（modified neurologi⁃cal severity score，mNSS）用于评价大鼠的运动、感觉、平衡和反射功能：评分范围为0~18分，分值越高，其神经损害越严重，评分方法参考相关文献［12］。

3.4 干湿比重法 用于检测脑组织含水量，观察水肿情况。大鼠麻醉后，迅速取脑组织。将其分为病灶侧皮质、病灶侧基底、病灶对侧皮质、病灶对侧基底及小脑5个部分。将脑组织分别放入锡纸中，称量湿重并记录。然后，将锡纸包裹的脑组织，放入恒温干燥箱（UF160，Memmert）中，以100℃烘干24 h。将烘烤后的脑组织取出，称量干重。脑组织含水量（%）=（湿重−干重）/湿重×100%。

3.5 标本的留取和制备 将麻醉成功的大鼠固定于操作台上，充分暴露大鼠胸腔，在右心耳处做一小切口。自左心室注入冰冷的生理盐水，将心血管系统内的血液冲洗干净。脑组织完整取出后去除小脑和脑干，仅留大脑。用于病理学检测的组织，在血液注射进针点冠状面将大脑分为前后两部分，放入4%组织细胞固定液中进行固定，随后进行蜡块包埋和组织切片；用于Western blot检测的组织，以血液注射进针点冠状面为基准，分别向其前后延伸1 mm距离，切取厚约2 mm的脑组织切片，并留取患侧纹状体脑组织，于液氮中存放24 h后，转入−80℃冰箱备用。所有操作均在冰上快速进行，以防止蛋白酶降解蛋白。

3.6 HE染色 用于观察血肿周围脑组织病理学变化及水肿情况。正置显微镜下（DM5300，Leica），每张切片选取4个视野进行拍照，每只动物选取3张切片进行观察。

3.7 FJC染色 用于检测血肿周围神经元退化情况。石蜡脑组织切片脱蜡至水后，用PBS冲洗，每次5 min，冲洗3次后将切片浸入0.06%的髙锰酸钾溶液中10 min（在摇床上轻摇）。从高锰酸钾溶液中取出切片，PBS冲洗3次，每次5 min。在避光环境下，将切片转移浸入0.000 1%的FJC染色液中染色30 min。用蒸馏水冲洗3次，每次5 min，切片周围水用纸巾擦干，晾干5 min，烤箱中（50℃）烘烤5 min。然后，将干燥后的切片置于二甲苯中进行透明，用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下（DM5300，Lei⁃ca），每张切片选取血肿周围组织4个视野进行拍照，并用ImageJ软件进行FJC阳性细胞数量统计。

3.8 Western blot 用RIPA裂解液进行脑组织匀浆后，在4℃下，12 000×g离心15 min。然后收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。将含有50µg蛋白质的上清液加入SDS-PAGE分离，然后将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜后，分别孵育caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18和β-actin抗体，于4℃过夜。然后，将TBST洗涤后的PVDF膜孵育过氧化物辣根酶标记的Ⅱ抗，于室温下放置90 min。使用ECL显色试剂盒进行显影，多功能激光扫描系统（Fusion FX5 Spectra，Vil⁃ber）检测蛋白含量，ImageJ软件进行灰度分析。

3.9 免疫荧光双标染色 石蜡切片脱蜡至水，稍甩干后用3%H2O2处理切片10 min，抑制内源性过氧化酶的活性，PBS漂洗3次，每次5 min。放入枸橼酸盐缓冲液中加热修复抗原10 min，室温冷却，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加羊血清，于37℃恒温箱中封闭1 h；轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加鼠源和兔源Ⅰ抗（GSDMD和Iba-1抗体，或GSDMD和NeuN抗体），于湿盒内4℃孵育过夜；次日用PBS漂洗3次，每次5 min。切片滴加两种相应种属的荧光Ⅱ抗，避光室温孵育30 min。PBS中漂洗3次后，滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。PBS中漂洗3次，抗荧光淬灭封片剂封片。正置荧光显微镜下（DM5300，Leica），观察并采集图像，用ImageJ软件进行分析。

3.10 免疫荧光与TUNEL双染 TUNEL（绿色）和Iba-1（红色）双染色用于评估ICH后小胶质细胞焦亡情况。石蜡切片经脱蜡至水、抑制内源性过氧化酶、抗原修复步骤后，根据TUNEL检测试剂盒（Roche）说明书，进行TUNEL染色；然后往切片上加入Iba-1抗体，4℃孵育过夜；次日将切片与荧光染料标记的Ⅱ抗在室温黑暗环境中孵育2 h；最后DAPI染核，抗荧光淬灭封片剂封片。在正置荧光显微镜下进行观察和拍照，每个切片在血肿周围选取3个视野，每个脑组织选取3个切片进行观察。使用ImageJ软件分析TUNEL阳性小胶质细胞数量。

4 统计学处理

用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用Tukey's检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ICH后患侧纹状体中caspase-1和GSDMD蛋白的表达及激活情况

Western blot结果显示，与sham组比较，caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均在ICH后72 h时显著升高（P<0.05），并且在72 h时病变最为明显，见图1。因此，本课题组选择ICH 72 h时点作为后续实验时点。

Figure 1.Western blot results for the changes of caspase-1（A）and GSDMD（B）activation and expression in the perihematoma after intracerebral hemorrhage（ICH）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group.图1 脑出血后血肿周围组织caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表达

2 抑制caspase-1对ICH大鼠神经功能的影响

前肢放置实验结果显示，与sham组比较，ICH大鼠左侧前肢放置成功率显著下降（P<0.01），而抑制caspase-1显著提高了大鼠左侧前肢放置成功率（P<0.05），见图2A。转角实验结果显示，与sham组比较，ICH大鼠左侧转身的百分比显著下降（P<0.05），而抑制caspase-1显著提高了大鼠左侧转身的百分比（P<0.05），见图2B。mNSS结果显示，与sham组比较，ICH大鼠mNSS显著升高（P<0.01），而抑制caspase-1显著降低了大鼠mNSS（P<0.05），见图2C。

Figure 2.Neurological function assessment in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：forelimb placement test；B：corner turn test；C：modified neurological severity score（mNSS）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.图2 脑出血大鼠的神经功能评估结果

3 抑制caspase-1对ICH大鼠神经损伤的影响

HE染色结果显示，sham组大鼠脑组织中神经细胞排列整齐、分布匀称，细胞组织结构染色均匀；ICH组大鼠血肿周围脑组织中小胶质细胞数量增加，神经细胞肿胀，排布不均，部分细胞固缩性坏死，染色加深；YVAD组大鼠血肿周围脑组织中神经细胞肿胀明显减轻，固缩坏死细胞数量减少，见图3A。干湿比重结果显示，与sham组比较，ICH大鼠病灶侧基底显著水肿（P<0.05），而抑制caspase-1显著缓解了病灶侧基底的水肿（P<0.05），见图3B。然而，与sham组比较，ICH大鼠病灶侧皮质、病灶对侧基底、病灶对侧皮质及小脑的水肿情况无显著差异。FJC染色结果显示，与sham组比较，ICH大鼠血肿周围脑组织中FJC染色阳性细胞数量显著增加（P<0.05），而抑制caspase-1显著减少了FJC染色阳性细胞的数量（P<0.05），见图3C、D。

Figure 3.Nerve injury in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：HE staining was used to observe the histopathological changes in the surrounding tissues of hematoma（scale bar=50µm）；B：the changes of brain water content in different parts of brain tissue（Ispi：ispilateral；Cont：contralateral；BG：basal ganglia；CX：cortex）in each group；C：representa⁃tive microphotographs and quantitative analysis of Fluoro-Jade C（FJC）-positive neurons in the surrounding tissues of hema⁃toma（scale bar=50µm）；D：representative image of the surrounding tissues of hematoma.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.图3 脑出血大鼠神经损伤情况

4 抑制caspase-1对ICH大鼠患侧纹状体中cas⁃pase-1和GSDMD蛋白表达及激活的影响

Western blot结果显示，与sham组比较，ICH大鼠脑组织中caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-cas⁃pase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均显著升高（P<0.05），而抑制caspase-1显著降低了上述蛋白的表达及激活水平（P<0.05），见图4。

5 抑制caspase-1对ICH大鼠血肿周围脑组织中TUNEL和GSDMD阳性神经元和小胶质细胞的影响

免疫荧光双标结果显示，与sham组比较，ICH大鼠血肿周围脑组织中GSDMD阳性表达小胶质细胞的数量显著增加（P<0.01），而抑制caspase-1显著减少了GSDMD阳性表达小胶质细胞的数量（P<0.01），见图5A。免疫荧光与TUNEL共染色结果显示，与sham组比较，ICH大鼠血肿周围脑组织中TUNEL阳性小胶质细胞的数量显著增加（P<0.01），而抑制caspase-1显著减少了TUNEL阳性小胶质细胞的数量（P<0.05），见图5B。免疫荧光双标结果显示，ICH组大鼠血肿周围脑组织中GSDMD阳性表达神经元数量与sham组比较无显著差异，见图5C。

6 抑制caspase-1对ICH大鼠患侧纹状体中IL-1β和IL-18蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与sham组比较，ICH大鼠脑组织中IL-1β和IL-18蛋白表达显著升高（P<0.05），而抑制caspase-1显著降低了IL-1β和IL-18的表达（P<0.05），见图6。

Figure 4.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK inhibited the activation and protein expression of caspase-1（A）and GSDMD（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.图4 Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表达

讨 论

1 由caspase-1介导的细胞焦亡在ICH后神经损伤中发挥重要作用

细胞焦亡是一种炎症程序性细胞死亡方式，兼具凋亡和坏死的特征［13］。焦亡细胞病理表现为核固缩，DNA断裂，TUNEL染色为阳性，但胞体增大，胞膜完整性被破坏，胞膜上形成1~2 nm的膜孔［5］。GSDMD是细胞焦亡的效应蛋白，属于gasdermin家族。GSDMD被激活的caspase剪切，释放N末端与细胞膜的脂质融合，形成膜孔，改变细胞的渗透压，破坏细胞膜的功能，使得细胞膜破裂，导致细胞焦亡［14］。

焦亡途径包括caspase-11或caspase-4/5介导的非经典焦亡途径和caspase-1介导的经典焦亡途径。在刺激信号作用下，pro-caspase-1被招募到炎症小体后二聚体化，激活其自身的蛋白酶活性，自剪切形成具有催化活性的caspase-1，caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18，使其活化成为有活性的IL-1β和IL-18，活化后的炎症因子通过GSDMD形成的膜孔释放至细胞外，募集更多的炎症细胞聚集，扩大炎症反应［15-16］。研究结果显示，ICH大鼠患侧纹状体中cas⁃pase-1和GSDMD的表达及活化在72 h内逐渐升高，表明ICH大鼠脑组织中出现了细胞焦亡。

Ac-YVAD-CMK是一种caspase-1选择性抑制剂，有研究显示其可以改善胶原酶诱导的ICH小鼠或大鼠的神经功能障碍和caspase-1介导的炎症反应［11，17］。为了进一步证实caspase-1介导的细胞焦亡对ICH后神经损伤的影响，我们在制备ICH模型前，将Ac-YVAD-CMK注入侧脑室，观察其对大鼠神经损伤和神经功能的作用。结果显示，Ac-YVAD-CMK显著改善了大鼠的神经功能障碍、组织病理学变化和脑组织水肿，减少了退行性神经元的数量，说明抑制caspase-1显著地改善了ICH大鼠的神经功能障碍和神经损伤，与其他学者的研究结果一致。同时，Ac-YVAD-CMK显著降低了ICH大鼠患侧纹状体内caspase-1和GSDMD的表达及激活水平，降低了IL-1β和IL-18的表达水平，说明抑制caspase-1显著抑制了ICH大鼠脑组织中的细胞焦亡。这些结果表明，caspase-1介导的细胞焦亡在ICH大鼠的神经损伤和神经功能障碍中发挥重要作用。

2 ICH后激活的小胶质细胞内发生caspase-1介导的细胞焦亡

小胶质细胞是中枢神经系统内特有的固有免疫细胞，约占脑内所有细胞总数的5%~10%［18］。当中枢神经系统受到损害时，小胶质细胞数分钟即被激活，并迁移到损伤部位［19-20］。激活后的小胶质细胞存在M1和M2两种状态：M1状态下的小胶质细胞主要作用为释放多种促炎因子来加强炎症反应，例如IL-1β、IL-18和MCP-1等［21］，M2状态下的小胶质细胞主要作用则为抑制炎症反应［22-23］。当小胶质细胞被过度活化，其释放大量的促炎细胞因子、趋化因子和氧化代谢物等会加剧神经损伤［24］。有研究显示，ICH发生后数分钟内小胶质细胞即被激活，且主要表现为M1型，产生IL-6和TNF-α等细胞因子，促进炎症反应，加重脑组织损伤［25］。虽然我们的研究结果显示，ICH大鼠脑组织中发生caspase-1介导的炎症反应和细胞焦亡，但焦亡发生在小胶质细胞内还是神经元内仍不清楚。为了进一步进行验证，我们采用免疫荧光双标和免疫荧光与TUNEL共染色的方法进行观察。结果显示，ICH大鼠血肿周围脑组织中GSDMD和TUNEL阳性小胶质细胞数量显著增加，Ac-YVAD-CMK可以显著减少GSDMD和TUNEL阳性小胶质细胞的数量。然而，对照组与ICH组大鼠血肿周围脑组织中GSDMD阳性神经元的数量无显著差异。这些结果说明ICH大鼠脑组织中caspase-1介导的细胞焦亡主要发生在小胶质细胞内。

Figure 5.The results of double immunofluorescence labeling and co-staining of immunofluorescence and TUNEL.A：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；B：repre⁃sentative microphotographs and quantitative analysis of TUNEL-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；C：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive neurons in the surrounding tissues of he⁃matoma.The scale bar=50µm.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs sham group；#P<0.05，##P<0.01 vs ICH group.图5 免疫荧光双标和免疫荧光与TUNEL共染色结果

Figure 6.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK in⁃hibited the expression of IL-1β（A）and IL-18（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.图6 Ac-YVAD-CMK抑制IL-1β和IL-18蛋白表达

综上所述，大鼠ICH发生后，小胶质细胞被激活，发生caspase-1介导的炎症反应和细胞焦亡，释放大量炎症因子，造成周围神经元退化，导致神经损伤和神经功能障碍。然而，造成小胶质细胞激活和神经元退化的机制仍有待进一步研究。