耳蜗内毛细胞中带状突触相关钙离子通道的研究进展

范历强 陈正侬

上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科（上海200233）

Ca2+通道是一种跨越细胞膜的结构，其化学本质是蛋白质，控制着Ca2+进入细胞的过程。Ca2+信号与很多重要生理功能相关，例如心脏收缩、基因转录等。声音诱导的内耳电信号在向中枢传递的过程中十分重要的环节-内毛细胞的带状突触传导，也与Ca2+通道的参与密切相关。目前，听觉突触中Ca2+通道的功能仍然处于不断探索的阶段，对突触中Ca2+通道的研究是揭露听觉奥秘的重要一环。下面主要介绍在内毛细胞带状突触活动中Ca2+通道的探索。

1 Ca2 +通道-胞吐作用偶联

快速同步胞吐作用需要胞外机制与突触前Ca2+通道紧密耦合。成像技术表明，带状突触是胞吐作用的关键点，并且带状结构对于快速、同步的神经递质释放十分重要。

内毛细胞带状突触的活动区包含大量的钙通道簇，这些簇主要由L型Cav1.3亚基组成[1,2]，辅助Cavβ2[3]，以及可能存在但尚未确定的Cavα2δ亚基，该通道的聚集取决于多个分子支架，包括巴松管或带状结构或两者兼有[4,5]以及RIM2α和β[6]。这些蛋白质的紧密的相互作用和其相应位置的正确对于建立正常的钙通道分布是必需的[4,6]，并且对于稳定AZ区域内的大的易释放池（readily releasable pool，RRP）至关重要[4,6,7]。此外，内毛细胞AZ还包含其他支架，例如Piccolo的短剪接变体Piccolino[8]，以及与突触前Ca2+通道直接相互作用的Usher蛋白harmonin，调节钙通道的门控开放并可能促进其蛋白酶体的降解[9,10]。尽管内吞机制仍然未知，但最近发现它包括AP-2[6,11]、动力蛋白[12,13]、两性蛋白和网格蛋白重链[13]。

除了与囊泡Ca2+感受器有关的通道的精确位置，其数量和开放概率外，Ca2+感受器的Ca2+结合特性和在AZ处的胞质Ca2+缓冲决定了偶联[14]。以前的工作已经通过结合听力刚出现时的小鼠内毛细胞中的全细胞Ca2+解偶联和Cm测量来检测融合后Ca2+传感器的Ca2+结合特性[15,16]。在这些实验中，表明需要四到五个Ca2+在融合之前协同结合，并且可以推测感受器的整体Ca2+亲和力较低。但是需要注意的是，这种方法会产生大量胞吐作用（增加的膜相当于细胞表面的15%）。因此，它不太可能完全由内毛细胞AZ的胞吐作用介导，但也可能涉及突触外胞吐作用。与Cm测量相关的特异性缺乏可能会使它的相应解释复杂化，需要通过使用更完善的方法使AZ（最好是较成熟的内毛细胞）进行胞吐来重新讨论突触小泡融合的内在Ca2+依赖性。

毛细胞有多个AZs，平均每个AZs含有数十个Ca2+通道[1,17-19]。然而，在给定的内毛细胞内，无论其具体在细胞内的位置如何，每个AZ的Ca2+通道数都有显著差异。这种突触前异质性被认为与声音编码的巨大动态范围有关[17,20-22]。一根听神经纤维具有较少Ca2+通道且需要更大去极化电位的突触后AZ，预期应该有更小的自发放电率，更高的阈值和更大的动态范围[23]。

内毛细胞中AZs的Ca2+通道密度和通道激活的电压依赖性成相反的分布梯度，即靠近SGN的一侧，Ca2+通道密度越高，而更难以被激活，远离SGN的一侧则Ca2+通道密度越低，但更容易被激活[24]。远离SGN的AZs的位置，轻微的去极化即可激活钙的内流。Ca2+内流在弱去极化时被激活。AZs分布在面对SGNs的这一侧，AZ大小与钙通道相关，且更大。

图1 [25]内毛细胞和耳蜗传入纤维之间的突触。Fig.1[25]The synapse between the inner hair cell and cochlear afferent fiberA.图中细胞左侧面向蜗轴，纤维（红色）具有高阈值和低自发放电率；右侧背向蜗轴，纤维具有低阈值和高自发放电率。B.毛细胞突触中的CaV1.3型钙通道。C.突触囊泡的高倍镜视野，谷氨酸转运蛋白Vglut3和Ca2+感受器otoferlin。D.突触小泡周期图。A.Fibers(red)synapsing on the left(modiolar)side have high threshold and low spontaneous discharge;fibers synaps‐ing on the right(pillar)side are thought to have low thresh‐olds and high resting spontaneous firing.B.CaV1.3-type cal‐cium channels in hair cell synapses.C.High power view of synaptic vesicle,glutamate transporter Vglut3,and Ca2+sensor otoferlin.D.Conventional view of the life cycle of the synap‐tic vesicle.

2 Ca2+内流与胞吐耦合

在去极化过程中，钙主要通过CaV1.3 L型Ca2+通道内流，触发RRP小泡的胞吐。Ca2+内流耦合到囊泡融合的方式决定了突触传递的性质[26]。可区分为两种情况[27-30]：（1）单纯 Ca2+纳米域控制，其中驱动给定囊泡融合的Ca2+由单个电压门控Ca2+通道贡献；（2）单纯Ca2+微米域控制，其中Ca2+传感器处的Ca2+量由一系列Ca2+通道整体控制，单个通道的影响可忽略不计。

带状结构下方条状簇中各个Ca2+通道的确切位置及其分子连接的囊泡释放位点仍尚待确定。生物物理约束建模[17,31]在识别分辨控制AZ成熟的分子过程，尤其是在出生后早期发育过程中Ca2+通道-突触小泡偶联的密切性逐渐提高这方面[17,19,31]是有用的。免疫组化显示内毛细胞AZ中最大钙离子通道开放概率的估计值，根据方法的不同在0.2[19]和 0.4[17]之间。

在一项研究[19]中，从P20沙鼠身上研究了底回内毛细胞（～ 30 kHz）。使用5mM细胞外钙离子和5uM BayK 8644进行单钙通道记录。当在34-37℃下进行记录时，BayK 8644的使用是必不可少的，因为在没有BayK 8644的情况下，大多数单通道开口没有被解决，并且表观亚导电开口状态变得非常频繁。已知BayK 8644能使L型Ca2+通道更长时间的开放，但不影响第一潜伏期，也不影响其基本的Ca2+电导和电压敏感性。因此，在活化动力学没有改变的情况下，它使Ca2+电流峰值增加约3倍。根据结果计算得钙离子通道开放概率为0.21。

3 Ca2+流入-胞吐作用偶联在发育中的变化

在发育过程中，偶联从Ca2+的微米域样控制到Ca2+的纳米域样控制[17]。这是根据成熟以及非成熟AZ的结构中胞吐的生物物理模型提出的。该模型表明，在每个成熟位点中，各个通道的Ca2+流入主导着Ca2+驱动的胞吐作用。作者基于形态学和生物物理数据，研究成熟AZ和未成熟AZ的Ca2+通道和Ca2+传感器的范式形态；对于成熟AZ，在囊泡Ca2+传感器接触的情况下，14个囊泡随机分布在80nm×420nm的突触前致密带的长边处。在突触前致密带内放置了14-90个通道；在情况1中，随机分布了36个通道。在情况2中，除了36个随机分布的通道外，还有14个通道与Ca2+感受器物理接触，模拟分子耦合，被称为“专用通道”，以突出显示其在给定囊泡的Ca2+信号中的优势。在情况3中，只布置了14个与囊泡钙传感器进行物理接触的通道。针对每种情况，考虑了100种不同的随机通道和囊泡位置实现。实验结果支持成熟内毛细胞中胞吐由钙纳米域控制这一概念。

Moser建议[26]，未来的实验应阐明簇内单个Ca2+通道的位置和迁移性，并剖析将释放位点连接至最近的Ca2+通道的推定接头蛋白。此外，进一步阐释CaV1.3 Ca2+通道复合物的分子组成，测试成孔CaV1.3α亚基的剪接变体的存在和作用，将有助于理解支配Ca2+通道表达的异质性的分子机制，激发-分泌偶联的发育性紧缩，以及各个Ca2+通道变异体对塑造各个内毛细胞激活域中突触前Ca2+内流效率的贡献。

4 Ca2+缓冲机制

内源性Ca2+缓冲对于突触信号传导很重要。在感觉HC中，Ca2+对于频率调谐，传入突触传递和传出调制至关重要。为了分离这些信号的传导途径并保持高时间保真度，Ca2+必须受到时间上的控制且在空间上被限制在其作用位点。细胞通过定点的Ca2+通道实现Ca2+内流和通过Ca2+与胞质缓冲液结合后排出游离Ca2+，来实现这个目的。在各种EF-hand Ca2+结合蛋白中，有些主要功能是作为Ca2+依赖信号蛋白的（例如，钙调蛋白和Ca2+结合蛋白 1-8，CaBP1-8），而 另 一 些 [parvalbumin-α（PVα），calbindin-D28k（CB）和Calretinin（CR）]被认为主要功能为Ca2+移动的缓冲液。不同物种的毛细胞强烈表达PV，CB，在某些情况下还表达CR。这可能由于功能上的需要不同分化出不同的Ca2+信号传导机制，反应了Ca2+需要具有不同生物物理特性的缓冲液。

内源性钙缓冲作用已经在不同种类的毛细胞中进行了研究[32-35]，均显示出钙结合位点的高浓度。在青蛙和鸡的毛细胞中，parvalbumin-3[34]和CR的浓度高达几个毫摩尔[32,36]。

对大鼠进行的免疫电镜研究表明，内毛细胞中有数百个蛋白钙结合位点[33]。在沙鼠内毛细胞中的膜片钳研究报告了相当于大约0.4 mM的1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸（BAPTA）的内缓冲剂[37]。在最近一项使用三重基因敲除小鼠（Pv-/-，Cb-/-，Cr-/-）的研究[31]中，尽管Ca2+依赖性失活电流增强，但在长时间去极化过程中仍观察到了过度的胞吐。在这个三重KO模型中，内毛细胞对RRP小泡的胞吐作用保持不变，这与预估的Ca2+通道和释放位点的紧密空间耦合一致。这些结果表明内源性EF-hand-Ca2+结合蛋白对内毛细胞突触递质释放的影响不大。这可能反映了Ca2+源（即Ca2+通道）和在AZ处进行融合的囊泡之间非常小的距离（“耦合距离”）。为了确定内毛细胞中的这种耦合距离，我们建立了一个模型来预测当改变Ca2+源和释放的Ca2+传感器之间的距离时所触发的相对胞吐量。该模型用于测定有效耦合距离，该距离与在室温下不同Ca2+缓冲条件下实验观察到的胞吐最佳匹配。在成熟的内毛细胞中，有效的“耦合距离”估计为17nm。这很好地符合Ca2+纳米结构域的胞吐作用的控制，类似于先前的估计（大约23纳米[38]）。

在该研究中，用不同浓度的合成Ca2+螯合剂，结合慢（EGTA）或快（BAPTA）动力学和刺激-分泌耦合的计算模型，结合Ca2+缓冲取代法测定外周血细胞Cm的变化。该实验表明，内源Ca2+缓冲液相当于1mM合成的Ca2+结合位点，其中一半的动力学速度与BAPTA相当。

在这只KO小鼠中，突触的声音编码基本上没有改变，这表明过度的胞吐发生在突触外。结论是EF-hand-Ca2+缓冲液调节突触前内毛细胞功能，促进代谢有效的声音编码。

综上所述，最近的研究对内毛细胞Ca2+通道探索包括单个钙通道的功能、Ca2+通道的蛋白结构、蛋白亚基的功能、Ca2+通道和Ca2+内流与突触囊泡及其胞吐的偶联方式、发育中Ca2+通道与突触囊泡偶联的变化、以及活动域（AZ）周围Ca2+缓冲机制进行了探索，帮助我们对Ca2+通道在听觉突触中对声音信号的编码的作用有了更深刻的理解。但是，对于内毛细胞上的Ca2+通道仍有很多未解之迷，仍需要进行进一步的探索。