当归芍药散防治非酒精性脂肪肝作用与肠道微生态的相关性研究*

河北中医学院药学院 河北省高校中药组方制剂应用技术研究中心

于泽鹤 彪雅宁 张睦清△ 刘晨旭 李子璇 韩一鹭 张一昕(石家庄 050200)

提要 目的：研究探讨当归芍药散防治非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用与肠道微生态的相关性。方法：60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组以及当归芍药散低、中、高剂量组，每组10只。通过喂饲高脂饲料复制NAFLD大鼠模型，造模同时给予相应药物治疗，8周后，采集血清、肝组织和大鼠粪便，检测血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝组织中TC、TG及游离脂肪酸(FFA)的含量或活性；苏木精-伊红(HE)染色法观察肝脏病理形态学变化；16sRNA测序法分析粪便肠道菌群组成结构。结果：模型组大鼠肝细胞内出现大量脂滴空泡积聚和气球样变，血清中TC、TG、ALT、AST以及肝组织中TC、TG、FFA的含量或活性均显著升高(P<0.01)，Simpon指数、厚壁菌门相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门的数值显著升高(P<0.01)，Chao1、Ace、Shannon指数、拟杆菌门相对丰度均显著降低(P<0.01)。与模型组相比，当归芍药散各剂量组大鼠肝细胞内脂滴空泡积聚和气球样病变均明显改善，血清中TC、TG、ALT、AST和肝组织中TC、TG、FFA的含量或活性均明显降低(P<0.05或P<0.01)，Chao1、Ace、Shannon指数、拟杆菌门相对丰度均明显升高(P<0.01)，Simpon指数、厚壁菌门相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门的数值均显著降低(P<0.01)。相关性分析结果表明，厚壁菌门、拟杆菌门分别与血脂含量呈正、负相关。结论：当归芍药散可能通过改善肠道菌群紊乱进行脂质代谢的调节，进而发挥降脂护肝的作用。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤[1]。流行病学显示，NAFLD在我国患病率约为15.0%，已经超过了病毒性肝炎和酒精性脂肪肝病，成为我国第一大慢性肝病[2-3]。NAFLD的发病机制尚不明确，新近研究发现肠道菌群失调对NAFLD的发生发展具有重要的影响，肠道菌群失调可通过胆汁酸代谢、内毒素血症、内源性乙醇等直接诱导NAFLD的发生[4]。当归芍药散出自《金匮要略》，原治妇人腹痛，有祛湿消痰、活血化瘀、调和肝脾之效，与NAFLD“肝脾失调，痰瘀互结”的病机相恰合。临床资料和实验研究表明当归芍药散可降低实验性高脂大鼠和血脂异常患者的血脂含量[5-6]，但其作用机制尚不明确。故本实验采用高脂饲料复制NAFLD大鼠模型，从肠道微生态的角度探讨该方防治NAFLD的机制，为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雄性，体质量160～180 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：110011200110219587，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 实验药物 当归芍药散组成：当归10 g，白芍、赤芍、川芎、泽泻各24 g，麸炒白术、茯苓各12 g。方中所用药物均为广东一方制药有限公司生产的中药配方颗粒，批号分别为0090273、0085633、0093093、0096173、0093073、0091283、0100213；多烯磷脂酰胆碱胶囊(北京赛诺菲制药有限公司，商品名易善复，228 mg/粒，2粒/次 ，3次/d)，批准文号：国药准字H20059010，生产批号：ABJD069B，以上药物均用100 ℃蒸馏水配制成所需浓度的药液。

1.3 实验试剂与仪器 总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，游离脂肪酸(FFA)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号分别为A111-2-1、A110-2-1、A042-1-1、C009-2-1、C010-2-1)均购于南京建成生物工程研究所有限公司；QIAampDNA提取试剂盒(批号：51604)购于上海恒斐生物科技有限公司；Humalyzer2000型半自动生化仪(德国Millimeter Mike公司)；1-15K型高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；RM2016型切片机(上海徕卡仪器有限公司)；DP73型数码显微镜(日本OlymPus公司)；Illumina MiSeq测序仪(美国Illumina公司)。

1.4 动物分组、造模及给药 大鼠适应性喂养1周后，按照体质量分层原则分为正常组、模型组、阳性药(易善复)组(0.144 g/kg)、当归芍药散低剂量(2.44 g/kg)、中剂量(4.88 g/kg)和高剂量组(9.76 g/kg)，每组10只。除正常组喂养普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料(78.8%基础饲料+15%猪油+5%蔗糖+1%胆固醇+0.2%胆酸钠)建立NAFLD模型。造模同时各用药组给予相应药液进行灌胃，正常组和模型组给予等量蒸馏水，给药剂量10 mL/kg，连续给药8周。

1.5 标本采集 于最后1次灌胃后麻醉大鼠，股主动脉取血，置洁净试管中，分离血清冷贮；迅速剖取部分肝组织-20 ℃冷藏；另取0.5×0.5×0.5 cm3大小的肝组织，4%多聚甲醛固定；收集各组大鼠粪便，置于冻存管中液氮保存。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 血清和肝组织生化指标检测：半自动生化分析仪检测血清中TC、TG、ALT和AST的含量或活性以及肝组织中TC、TG的含量、手动生化法检测肝组织中FFA的含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.6.2 HE染色法观察肝组织的病理形态学变化：将4%多聚甲醛液中固定的肝脏取出，常规脱水处理、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理形态学变化。

1.6.3 粪便DNA提取与16sRNA测序分析：根据治疗效果，选用正常组、模型组和治疗效果较好的当归芍药散高剂量组的大鼠粪便进行肠道菌群分析。从粪便中提取肠道微生物DNA，同时采用NanodroP对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R引物(5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′)对提取出来的DNA中V3～V4区进行PCR扩增。将纯化后的PCR进行荧光定量，采用TruSeq Nano DNA LT Library PreP Kit制备测序文库，将获得的DNA片段用Illumina MiSeq测序平台进行测序。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中TC、TG含量和ALT、AST活性变化情况 与正常组比，模型组大鼠血清中TC、TG含量以及ALT、AST的活性均明显升高(P<0.01)；与模型组比，各用药组大鼠血清中TC、TG含量和ALT、AST的活性均明显降低(P<0.01)；中剂量组大鼠血清中ALT和高剂量组ALT、AST的活性均明显低于阳性药组和低剂量组(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠血清中TC、TG、ALT和AST含量或活性的比较

2.2 各组大鼠肝脏脂质的含量变化 与正常组比，模型组大鼠肝脏中TC、TG和FFA的含量均明显升高(P<0.01)；与模型组比，各用药组大鼠肝组织中TC、TG和FFA的含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与阳性药组比，低剂量组大鼠肝组织中TC含量明显升高(P<0.05)，高剂量组大鼠肝组织中TC含量明显降低(P<0.05)；与低剂量组比，中、高剂量组大鼠肝组织中TC含量均明显降低(P<0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠肝组织中TC、TG和FFA含量的比较

2.3 各组大鼠肝脏病理形态学变化 HE染色结果提示：正常组大鼠肝小叶清晰，肝细胞大小均匀，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列，胞浆均匀，细胞核圆且位于中央；模型组大鼠肝细胞索排列紊乱，肝细胞内可见大量的脂滴空泡积聚和较多的气球样变；与模型组比，各用药组肝细胞的脂滴空泡积聚和气球样变均减轻，尤以高剂量组改善明显。

2.4 Alpha多样性指数 Alpha多样性指数可以反映肠道菌群的丰富度和多样性，包括Chao、Ace、Simpson和Shannon指数，其中Chao和Ace数值越大，说明物种丰富度越高；Simpson指数越小，Shannon指数越大，说明物种多样性越高。结果显示，与正常组比，模型组Chao1、Ace以及Shannon指数均明显降低(P<0.01)，Simpson指数明显升高(P<0.01)，说明模型组大鼠肠道菌群的丰富度和多样性均降低。与模型组比，当归芍药散高剂量组Chao1、Ace以及Shannon指数均明显升高(P<0.01)，Simpson指数明显降低(P<0.01)，表明当归芍药散高剂量可升高模型大鼠肠道菌群的丰富度和多样性。详见表3。

表3 各组大鼠Alpha多样性指数比较

2.5 各组大鼠肠道菌群组成结构分析及优势菌与血脂含量相关性分析 16sRNA测序结果显示，在门分类学水平上有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、TM7、疣微菌门(Verrucomicrobia)等10类主要细菌，其中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌。见图1。

注：C-正常组，M-模型组，G-当归芍药散高剂量组(下同)。图1 大鼠肠道菌群组成情况

对各组优势菌相对丰度进行分析，结果显示：与正常组和当归芍药散比较，模型组厚壁菌门相对丰度明显升高(P<0.01)，拟杆菌门相对丰度显著降低(P<0.01)。比较2个优势菌的比值，模型组中厚壁菌门与拟杆菌门比值明显高于正常组(P<0.01)，而当归芍药散高剂量组中二者的比值明显低于模型组(P<0.01)。见图2、图3。

注：与正常组比，**P<0.01；与模型组比，## P<0.01。

注：与正常组比，**P<0.01；与模型组比，## P<0.01。

相关性分析结果表明，厚壁菌门与血清中TC和TG的含量成正相关(P<0.01)，拟杆菌门与血清中TC和TG的含量成负相关(P<0.05)。见图4。

注：r<0 为负相关，r>0 为正相关，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 讨论

中医学中并没有NAFLD这一病名，根据其致病特点及临床表现，将其归属为“胁痛”“积聚”“痰浊”等范畴。NAFLD多是由于过食精肥甘甜、所欲不遂、怠惰懒动等原因导致脾运失职，湿聚成痰；肝失疏泄，气机不畅，气滞则血瘀，痰瘀互结于肝而成，故肝脾失调，痰瘀互结为其主要病机，消痰化瘀，调肝运脾为其有效治法。

《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治第二十》记载“妇人怀妊，腹中疞痛，当归芍药散主之”。方中当归、芍药配用养肝血、祛瘀滞，川芎畅肝行气、活血化瘀，为“血中气药”，3味血药同用，共奏养血活血、调肝化瘀之功，重在调肝。白术、茯苓相合培土健脾、燥湿利水，泽泻淡渗利水、祛湿消痰，3味水药伍用，既可益气健脾以杜绝水湿痰浊生成之源，又可消散已成之痰湿，合以治脾。全方3血3水之品，相济并用，肝脾同调，血湿同治，共成祛湿消痰、活血化瘀、调和肝脾之效。当归芍药散的组方用药与NAFLD病机相恰合，根据中医学“异病同治”的原则，故选为该病的治疗方剂。

肠道菌群与宿主形成共生关系，有调节宿主免疫功能、防止外来微生物入侵、调节能量代谢等功能[7]。小肠中未被消化吸收的碳水化合物是肠道菌群的主要养料来源，若长期进食高脂食物，可使肠道菌群的养料减少，同时，高脂饮食的部分代谢产物可破坏肠道菌群所处的微生态环境，从而导致肠道菌群失调[8]。拟杆菌门和厚壁菌门为肠道菌群的两大优势菌，约占肠道菌群含量的99%[9]。拟杆菌门与代谢性疾病呈负相关，厚壁菌门则与之呈正相关，二者的比值能够影响肌体对热量的吸收。若厚壁菌门数量高于拟杆菌门，则肌体吸收热量会增加，反之则减少[10]。已有研究表明，在NAFLD模型大鼠肠道中，厚壁菌门/拟杆菌门的数值明显高于正常组[11]，且肠道中厚壁菌门每增加20%，拟杆菌门每减少20%，宿主就会增加约150 kcal的能量摄入[12]。

本实验结果显示，与正常组比较，模型大鼠经当归芍药散治疗后，血脂和肝脏脂质含量均明显降低，肝损伤减轻，肝细胞中脂滴空泡积聚和气球样变均明显改善，表明当归芍药散有良好的降脂保肝效果。Alpha多样性指数结果显示，模型大鼠肠道菌群的丰富度和多样性降低，与文献报道的高脂饮食可降低肠道菌群物种的丰富性与多样性相一致[13-14]，而当归芍药散可恢复模型大鼠肠道菌群物种的丰富性与多样性。模型组大鼠厚壁菌门相对丰度和厚壁菌门与拟杆菌门的比值明显升高，拟杆菌门相对丰度明显降低，当归芍药散可明显降低NAFLD大鼠厚壁菌门相对丰度以及厚壁菌门与拟杆菌门的比值，明显升高拟杆菌门相对丰度。肠道菌群与血脂含量相关性分析结果表明，厚壁菌门丰度与血清中TC和TG的含量成正相关，拟杆菌门丰度与血清中TC和TG含量成负相关，可见当归芍药散的降脂护肝作用与肠道菌群密切相关。综上可知，当归芍药散防治NAFLD的机制可能与调节肠道菌群结构有关。