血管内皮生长因子和性别决定区Y-17对慢性心力衰竭的诊断价值

申达甫，何志伟

1.上海交通大学医学院附属仁济医院心血管外科，上海200127；2.上海邮电医院普外科，上海200040

心力衰竭是一种十分常见的临床综合征，以呼吸困难、容易疲劳和容量负荷过重为特征，可以出现外周水肿和肺啰音等体征[1-2]。心力衰竭的症状可由收缩或舒张功能障碍引起。心力衰竭的发病率和死亡率很高，特别是在老年人中[3-4]。我国每年约新发心力衰竭患者50 万例[5]。许多疾病，如冠状动脉疾病、高血压、心脏瓣膜病和糖尿病，可引起或导致慢性心力衰竭失代偿。慢性心力衰竭患者需要长期进行药物治疗和随访，不断增加患者以及社会负担。高发病率和不良预后使得对该疾病的早期诊断和及时治疗尤为重要。慢性心力衰竭的诊断需要依据病史和体格检查、胸片、心电图、心脏彩超和实验室检查等。目前并没有单一诊断试验可以确诊慢性心力衰竭。具有高灵敏度、高特异度的血清学标志物可以应用于早期非侵入性的筛查。近年来，随着实验技术的进步，不断发现新的血清标志物可以用于慢性心力衰竭的诊断或者风险分层。这些标志物往往具有自身特异性，并且与特异的疾病的致病机制通路相关。联合应该这些指标可以提高诊断效能，包括特异度和灵敏度[6-8]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与性别决定区Y-17（sex determining region Y-box 17,SOX17）均被证实与心力衰竭相关[9-10]，是可能用于心力衰竭诊断的潜在标志物。本研究旨在探索，VEGF与SOX17 作为血清学标志物在慢性心力衰竭诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 招募2020年1月—2021年1月在上海交通大学医学院附属仁济医院住院治疗的慢性心力衰竭患者50 例，设立为观察组，50 名健康者设立为对照组。观察组纳入标准：（1）根据患者临床症状、体格检查结果、辅助检查结果，诊断为慢性心力衰竭，诊断标准参照中华医学会心血管病学会心力衰竭学组2018 版《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》[11]；（2）患者病程超过半年以上；（3）患者年龄在60 岁至75岁之间；（4）患者知晓本研究内容与意义，自愿参加本研究本签署知情同意书。观察组排除标准：（1）合并恶性肿瘤者；（2）合并急慢性感染者；（3）合并精神心理类疾病，不能正常交流者；（4）近半年内参与其他临床试验者。对照组入组标准：（1）既往无心脑血管疾病病史；（2）健康者年龄在60 岁至75 岁之间；（3）使用抗VEGF 药物患者；（4）患者知晓本研究内容与意义，自愿参加本研究本签署知情同意书。对照组排除标准参照观察组。本研究通过上海仁济医院伦理委员会审核批准。记录患者的一般资料，包括年龄、性别、平均身高、体重、收缩压、舒张压、吸烟史、饮酒史、糖尿病病史。记录患者N 末端B 型利钠肽前体(NT-proBNP) 和超声心动图参数（每搏量和射血分数）。

1.2 观察指标检测 本研究使用人血清VEGF 酶联免疫试剂盒（德国merck-millipore 公司，货号：QIA51-1EA）和SOX17 酶联免疫试剂盒（美国raybiotech 公司，货号：ELH-SOX17-2）。取患者早晨空腹血样5mL，经离心机（德国BAXIT 公司，型号：BXTGL16M）离心后，分离上层血清。使用包被稀释液稀释好的抗原在96 孔板上进行加样，每孔加入100 L。在4℃的环境中放置24 h。放置时要求物理封闭96 孔板，防止液体蒸发。完成上述步骤之后，丢弃96 孔板中液体。使用小牛血清封闭酶标反应孔，封闭时间应超过40 min。本研究要求封闭时，血清加满反应孔，放置于37℃的恒温箱中。封闭完成后充分洗涤反应孔。将待检测血清建立合适浓度梯度后加入孔板，重复3 次。本研究要求放置于37℃的恒温箱中，时间为1 h。上述步骤完成后充分洗涤反应孔。加入酶标抗体，放置于37℃的恒温箱中，反应时间为1 h。最后加入底物液TMB-过氧化氢尿素溶液，放置于37℃的恒温箱，避光反应3 min。终止反应，并使用酶标仪测量吸光度，计算所测目标因子血清含量，取3 次测量平均值。

1.3 统计学分析 本研究中所用统计学数据使用R 软件（V3.5.1）和相关R 包进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本 检验；计数资料以例数和百分率表示，采用卡方检验。通过Logistic 回归分析筛选慢性心力衰竭独立危险因素并建立联合诊断指标。通过受试者工作特征(Receiver operatingcharacteristic，ROC) 曲线评估VEGF、SOX17、以及联合指标诊断效能。使用STRING 11.0 构建VEGF、SOX17 为核心的蛋白相互作用网络。利用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路数据库和PathView软件对VEGF、SOX17 相关的基因进行信号通路富集分析。<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组之间一般情况比较 本研究观察组和对照组一般情况如表1 所示，2 组之间在平均年龄、性别、平均身高、体重、收缩压、舒张压、吸烟史、饮酒史、糖尿病史等方面差异无统计学意义（>0.05）。50 例心衰患者中18（36.00%）例患冠心病、13（26.00%）例患高血压病、6（12.00%）例患心肌炎、5（10.00%）例患有扩张性心肌病、10（20.00%）例患有瓣膜病。2 组之间NT-pro BNP 和超声心动图参数之间差异有统计学意义（<0.001）。见如表2。

表1 2 组基线情况比较

表2 2 组NT-pro BNP 和超声心动图参数比较

2.2 2 组之间VEGF 与SOX17 血清含量差异 对照组VEGF 血清含量（72.29±37.20） pg/mL，观察组VEGF 血清含量（122.73±67.85）pg/mL；观察组VEGF血清含量高于对照组（<0.001）。对照组SOX17血清含量（94.80±49.49）pg/mL，观察组SOX17 血清含量（142.34±87.64）pg/mL；观察组SOX17 血清含量高于对照组（<0.001）。见图1。

图1 对照组和观察组血清VEGF、血清SOX17 含量差异比较

2.3 Logistic 回归分析本研究以慢性心力衰竭患病情况为因变量，SOX17 和VEGF为自变量，进行Logistic回归分析。结果表明，SOX17（OR=1.32,95%[0.96,1.36]）和VEGF（OR=1.41,95%[1.06,1.62]）是慢性心力衰竭的独立危险因素（<0.05）。见表3。

表3 血清SOX17、VEGF 含量Logistic 回归分析

本研究基于SOX17 和VEGF 构建风险值计算公式：风险值=-2.96+0.01×SOX17 血清含量+0.02×VEGF 血清含量。ROC 曲线表明，SOX17 曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.67，95%CI 为[0.57,0.76]，最佳临界值为115.89 pg/mL，敏感度为48%，特异度为82%。VEGF 的AUC 为0.76，95%CI 为[0.67,0.84]，最佳临界值为79.32 pg/mL，敏感度为76%，特异度为74%。风险值的AUC 为0.81，95%CI 为[0.72,0.88]，最佳临界值为0.60，敏感度为78%，特异度为82%。此外，本研究还纳入了NTpro BNP 作为参照，其AUC 为0.762，小于风险值AUC，表明联合指标风险值诊断效能优于NT-pro BNP。

图2 VEGF、SOX17 血清含量对慢性心力衰竭诊断受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic，ROC）

2.4 SOX17、VEGF 蛋白质相互作用网络构建 本研究构建了SOX17、VEGF 蛋白质相互作用网络。见图3。

图3 SOX17、VEGF 蛋白质相互作用网络。线条越粗表示相互间作用关系支持越强

2.4 KEGG 通路富集 分析本研究将SOX17、VEGF及相互作用蛋白质进行KEGG 通路富集。结果显示，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白质基因主要富集在钙信号通路、扩张型心肌病、糖酵解和糖质新生、松弛素信号通路、ECM 受体交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡、HIF-1 信号通路、蛋白质消化吸收等信号通路上（<0.05）。见图4。

图4 SOX17、VEGF 及相互作用蛋白质进行KEGG 通路富集分析

3 讨论

心力衰竭被美国心脏协会和美国心脏病学会定义为一种复杂的临床综合征，可由任何结构性或功能性心脏疾病导致，损害心室充血或输出血液的能力。由于心肌受到压力，心输出量减少，交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活增加了血压(组织灌注) 和血容量(通过Frank-Starling 机制增加前负荷、搏出量和心输出量)。这些代偿机制也可导致进一步的心肌恶化和心肌收缩性恶化。近年来，有研究发现了一些可以用于慢性心力衰竭的诊断血清学标志物，包括生长刺激表达因子-2、半乳糖凝集素-3、生长分化因子-15 等，但是均未广泛应用于临床实践中[12]。本研究旨在探索，VEGF 与SOX17 作为血清学标志物在慢性心力衰竭诊断中的价值。

本研究通过ELISA 的方法测定了慢性心力衰竭患者和健康受试者血清中VEGF、SOX17 血清中的含量。研究发现，慢性心力衰竭患者VEGF 血清含量高于健康受试者。这一结果得到了既往研究和文献的支持，慢性心力衰竭患者血清中VEGF 水平升高，经过治疗之后有所降低[13-14]。慢性心力衰竭患者血清中SOX17 血清含量高于健康受试者。SOX17 与慢性心力衰竭之间的关系尚缺乏相关研究阐明，本研究这一结果需要进一步扩大样本量进行证实。

本研究通过Logistic 回归分析发现，SOX17 和VEGF 是慢性心力衰竭的独立危险因素，并且构建了风险值计算公式，并进一步探索了VEGF、SOX17 以及两者的联合诊断效能。ROC 曲线表明，SOX17、VEGF、风险值的AUC 分别为0.67、0.76、0.81，最佳临界值以及对应的敏感度和特异度分别为115.89 pg/mL（0.48,0.82）、79.32pg/mL（0.76,0.74）、0.60（0.78,0.82）。上述结果表明，VEGF 和SOX17 均可以独立应用于慢性心力衰竭的诊断，并且诊断效能良好。VEGF 和SOX17 联合构建的风险值作为诊断指标，其效能高于两者独立作为诊断指标。此外，本研究还纳入了NT-pro BNP 作为参照，其AUC 为0.762，小于SOX17 和VEGF 联合指标风险值AUC，表明联合指标风险值诊断效能优于NT-pro BNP。

本研究构建了SOX17、VEGF 蛋白质相互作用网络，并且对相互作用基因进行了KEGG 通路富集分析。富集分析结果表明，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白质基因主要富集在钙信号通路、扩张型心肌病、糖酵解和糖质新生、松弛素信号通路、ECM 受体交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡、HIF-1 信号通路、蛋白质消化吸收等信号通路上。值得注意的是这些通路之中，HIF-1在心衰的致病过程中发挥重要作用，HSF1 缺陷通过内皮细胞mir-195a-3p 介导的心脏血管生成损伤，加速了压力超载诱导的心肌肥肥大向心力衰竭的转变[15]。也有研究证实P53 的缺失部分通过抑制HIF1 信号传导来逆转压力过载引起的心脏重构[16]。钙信号通路、扩张型心肌病信号通路同样被证实在慢性心力衰竭致病过程中发挥重要作用[17]。相关研究还表明细胞凋亡与心力衰竭发生进展相关。miR-122 心脏特异性过表达诱导线粒体依赖的心肌细胞凋亡并通过抑制Hand2促进心力衰竭[18]。构建蛋白质相互作用网络以及KEGG通路富集分析得出的结果，可以为慢性心衰的致病机制提供新的思路，发现潜在的生物学标志物和新的治疗靶点。

综上所述，本研究发现，VEGF 和SOX17 均可以独立应用于慢性心力衰竭的诊断，并且诊断效能良好。VEGF 和SOX17 联合构建的风险值作为诊断指标，其效能高于两者独立作为诊断指标，值得在临床应用中进行推广。