小鼠孕晚期暴露脂多糖对老年期海马GSNOR含量及与认知功能损害相关性研究

张雨欣，庄战强，韦琪瑶，陈贵海，曹 磊

年龄相关性认知功能减退(age-associated cognitive decline，AACD)是衰老的常见症状和老年期痴呆的重要危险因素。阐明AACD的确切发病机制对于理解正常衰老向老年期痴呆的转化具有重要意义。S-亚硝基化即NO将蛋白质半胱氨酸残基氧化修饰形成S-亚硝基硫醇(s-nitrosothiols,SNOs)，为机体提供NO生物活性。而线粒体蛋白的过度S-亚硝基化会直接影响线粒体动力学活性、下调有氧代谢的效率以及抑制线粒体自噬功能，破坏线粒体稳态。S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR)是一种对S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)具有高度特异性的去硝基酶，可催化去硝基反应，控制GSNO和蛋白SNOs的细胞内水平，并保护机体免受亚硝化应激的伤害。研究表明，全脑GSNOR的表达会随着年龄的增长而下降，其缺乏会因亚硝基化应激而损害线粒体功能。研究表明，妊娠动物的内分泌等系统较非妊娠同龄动物显著不同，导致其对不良因素，尤其是感染的敏感性更高，妊娠晚期更甚，且孕晚期炎症暴露可以加速母亲衰老过程中的AACD。然而海马GSNOR是否参与空间学习记忆损害的相关性尚不了解，更不知孕晚期炎症暴露是否会恶化此过程。该研究旨在探讨孕晚期炎症暴露对老年母鼠海马GSNOR水平的影响及其与空间学习记忆能力改变的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物处理

CD-1小鼠，2月龄，雄鼠30只，雌鼠60只，购于南京大学模式动物研究院。标准实验条件下饲养，保持明暗周期 12 h，适宜温湿度，自由进食饮水。CD-1小鼠于晚9：00按1 ∶2(雄 ∶雌)合笼，首次查到阴栓者为受孕第0天(G0)。在G15，将孕鼠随机分为LPS组和CON组，LPS组连续4 d每天腹腔注射LPS 50 μg/(kg·d)，CON组则同期腹腔注射等容量生理盐水，分别在饲养至6月龄和18月龄时，每组(6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS)随机抽取6只进行实验。有外伤、残疾或是疾病的小鼠不纳入实验。本实验经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 Morris水迷宫实验

将直径10 cm，高24 cm的可移动的圆柱状逃生平台放入直径150 cm，高30 cm的黑色圆形水池中，向水池中注入温度适宜的自来水，控制水位高于平台1 cm，运用Any-maze软件对小鼠在水迷宫中的运动轨迹进行分析，检测其空间学习记忆能力。在距水池50 cm处用白色布帘围起以屏蔽外界因素对实验的干扰，并在距池底平面1.5 m高的帘子上等距离黏贴3个不同形状的黑色标志物，作为小鼠进行空间定位的线索。实验过程分为学习(定位航行)期和记忆(空间探索)期。① 学习期：在连续7 d的定位航行中，逃生平台低于水面1 cm并固定于靶象限的中心。仅在第1天实验开始前，将小鼠放在平台上停留30 s以适应，每天将小鼠面对水池的外沿随机从任一象限投入水中，允许其最多游泳60 s寻找平台。实验小鼠每只每天进行4次训练，每次相隔15 min。记录每次找到平台前的平均游泳距离，距离越短代表学习能力越强。② 记忆期：在学习期的第7天，完成4次训练后将逃生平台拿出，小鼠恢复体力后从平台放置象限(靶象限)相对的象限再次入水，在水池中任意游泳60 s。60 s内靶象限的游泳距离占总游泳距离的百分比越大代表记忆能力越强。

1.3 Western blot 分析

在行为学任务完成2周后，将小鼠引颈脱臼处死，冰上取脑并迅速剥离海马，于-80 ℃超低温冰箱保存。使用蛋白质中性裂解缓冲液进行组织裂解,提取蛋白，使用双软骨酸测定试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白溶解到等浓度后，按照1 ∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10 min。室温冷却后按每孔5～10 μl注入SDS-PAGE胶加样孔内。电泳仪参数设置为80 V，30 min用于浓缩胶；再设为120 V，1 h用于分离胶。恒流转膜，漂洗5 min，再加入5%脱脂奶粉作为Western封闭液，在室温封闭2 h。加入兔多克隆anti-GSNOR一抗(1 ∶800，美国Proteintech公司)，4 ℃孵育过夜,孵育结束后使用PBST洗涤。加入辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000，北京Zs-Bio公司)，室温孵育2 h，之后用PBST洗涤。用ECL试剂盒对免疫反应的靶蛋白条带进行可视化，使用Image J软件进行蛋白条带的结果分析，计算GSNOR的相对表达量。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

2.1.1

定位航行 使用重复测量数据方差分析比较学习期数据可得，游泳路程随训练天数的增加而逐渐减少(

F

=29.683，

P

<0.01)，且6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS组间的游泳路程差异有统计学意义(

F

=13.073，

P

<0.01)。两两比较分析显示，18-CON组游泳路程长于6-CON组，差异有统计学意义(

F

=12.510，

P

<0.01；图1A)；18-LPS组也长于18-CON组,差异有统计学意义(

F

=25.579，

P

<0.01；图1B)。而6-LPS组和6-CON组小鼠游泳路程差异无统计学意义(

F

=0.040,

P

=0.845;图1C)。

2.1.2

空间探索 整体分析可见6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS组间的游泳路程百分比差异有统计学意义(

F

=45.833，

P

<0.01)，组间比较显示，18-CON组小鼠靶象限游泳路程百分比低于6-CON组，差异有统计学意义(

F

=52.616，

P

<0.01)；18-LPS组小鼠靶象限游泳路程百分比也低于18-CON组,差异有统计学意义(

F

=10.582，

P

<0.01)。而6-LPS组和6-CON组小鼠靶象限游泳路程百分比差异无统计学意义(

F

=1.242，

P

=0.291;图1D)。

图1 小鼠Morris水迷宫中的成绩A、B、C:学习期平均游泳路程；D：记忆期靶象限内的路程百分比；与6-CON组比较：**P<0.01；与18-CON组比较：##P<0.01

2.2 海马GSNOR水平

6-CON、6-LPS、18-CON和18-LPS四组间的海马GNSOR表达水平差异有统计学意义(

F

=201.862，

P

<0.01)，组间比较显示，18-CON组小鼠海马GSNOR(

F

=107.011，

P

<0.01)水平低于6-CON小鼠，6月龄(

F

=59.449，

P

<0.01)和18月龄(

F

=185.086，

P

<0.01)LPS组小鼠海马GSNOR水平也低于同月龄CON组，差异均有统计学意义，见图2。

图2 Western Blot检测小鼠海马GSNOR的表达与6-CON组比较：**P<0.01；与18-CON组比较：##P<0.01

2.3 空间学习记忆能力与海马GSNOR水平的相关性

Pearson分析表明，18-CON组和18-LPS组小鼠海马GSNOR水平与游泳路程呈负相关(

r

=-0.836，

P

=0.038;

r

=-0.825，

P

=0.043)，与靶象限游泳路程百分比呈正相关(

r

=0.856，

P

=0.030;

r

=0.901，

P

=0.014)；而6-CON组和6-LPS组小鼠海马GSNOR水平与平均游泳路程和靶象限游泳路程均无相关性(

P

>0.05)，见表1。

表1 GSNOR与Morris水迷宫成绩的相关性[r (P值)]

3 讨论

在人和啮齿动物的正常衰老过程中，认知功能如空间记忆、工作记忆和长期记忆等逐渐下降。海马在正常学习记忆巩固中发挥重要作用，但非常脆弱，比其他脑区更早发生衰老引起的结构和功能变化。本课题组前期研究表明海马相关的空间学习记忆功能会随衰老进展而受损，且孕晚期暴露LPS会加速这种损害。LPS是一种常用于模拟实验动物的细菌感染的强效内毒素，可提供持续的炎症刺激。由LPS介导的全身性炎症会引发神经炎症，进而影响认知功能。怀孕的动物对LPS的敏感性增加，LPS引发母体免疫激活，导致母亲和胎儿关键脑区基因表达异常。本研究中，18-CON组比6-CON组平均游泳路程延长(

P

<0.01)，靶象限游泳路程百分比降低(

P

<0.01)；18-LPS组比18-CON组的游泳路程延长(

P

<0.01)，靶象限游泳路程百分比降低(

P

<0.01)。这些结果与既往研究一致，即小鼠的空间学习记忆功能在衰老时受损，而孕晚期LPS暴露加重了这种损害。线粒体自由基衰老理论认为衰老是线粒体损伤累积的结果，线粒体功能障碍是多种年龄相关性疾病病理生理学的重要过程。许多参与氧化呼吸反应、线粒体动力学和线粒体自噬的线粒体蛋白质活性受到S-亚硝基化反应调节，过度S-亚硝基化会破坏线粒体正常的结构和功能，从而促进神经退行性疾病的发展。GSNOR作为重要的去硝基酶催化S-亚硝基化的线粒体蛋白的还原反应，与硝基酶共同调控细胞内蛋白S-亚硝基化水平。在啮齿动物和人类衰老过程积累的初级衰老细胞中，发现GSNOR的表达减少。GSNOR缺陷(GSNOR)的小鼠脑中蛋白质S-亚硝基化的程度大大增加，并表现出加速衰老的一些特征，如肌肉质量减少和神经肌肉功能障碍，且大脑皮质α突触核阳性蛋白出现积累。所以，GSNOR下调可能是衰老的重要指标。本研究中，18-CON组比6-CON组小鼠海马GSNOR水平下降(

P

<0.01)，表明衰老可降低小鼠海马GSNOR表达；6月龄和18月龄LPS组比同年龄CON组小鼠海马GSNOR表达水平降低(

P

<0.01)，这表明孕期暴露LPS可能下调小鼠海马GSNOR蛋白表达，尤其是老年小鼠。然而6月龄时LPS组并未表现出MWM成绩差异，这提示GSNOR水平的降低可能是认知功能损害的前驱症状。进一步分析可得，海马GSNOR水平与空间学习记忆能力的相关性仅见于18月龄小鼠，且6-LPS组GSNOR含量相较于6-CON组只下降了30%，而18-LPS组GSNOR含量在18-CON组较6-CON组下降40%的基础上再降低了70%。因此我们推测海马GSNOR水平与年龄相关性空间学习记忆减退有关，而青年期小鼠由于线粒体功能损伤轻微或脑内其余机制的代偿尚未引起认知改变。在老年期(18月龄)，海马线粒体损伤积累超过代偿能力，表现出空间学习记忆能力的下降。

综上所述,孕期暴露LPS加速老年母鼠空间学习记忆能力损害的作用至少涉及海马线粒体GSNOR表达的严重降低。本课题组选定妊娠晚期这一特殊时期，研究炎症刺激对于AACD的影响，而未将妊娠期作一因素变化，后期课题组将增加同龄非孕小鼠炎症刺激对照组，进一步证实妊娠对于学习记忆的影响。将来的研究应进一步探索基因表达水平和GSNOR的降解因素如SUMO化、泛素化改变等。