胶质瘤细胞外泌体通过miR-125b对细胞增殖凋亡的影响

刘彦廷，孙 拯，王壮壮，龚 伟，马金阳，田春雷

胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤之一，目前临床上多采用手术+放化疗等综合治疗为主，但患者复发率极高，整体预后差。胶质瘤细胞可分泌一种直径约40～100 nm细胞外膜性囊泡，即外泌体，不仅可作为细胞间的通信载体，还可通过携带miRNAs调控肿瘤细胞的增殖凋亡。目前发现，miR-125b与胶质瘤组织恶性程度存在相关性，可通过抑制下游靶基因，调控胶质瘤细胞的增殖凋亡。如：miR-125b可通过抑制DNA损伤DRAM2、P53和P38等靶基因，改变肿瘤细胞的增殖活性。该研究拟通过提取胶质瘤细胞的外泌体，将其与U251细胞共培养，观察外泌体能否通过miRNAs调控胶质瘤细胞增殖凋亡，为该领域的研究提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人胶质瘤细胞U251与人星型胶质细胞购于南方医科大学神经病学研究实验室细胞库，RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，CCK-8试剂盒购于美国Sigma公司；兔抗人CD63、CD9和phalloidin单克隆抗体均购于美国Cell Signaling Technolog公司，β-actin单克隆抗体购于上海康成生物公司；胎牛血清、培养基购于美国Gibco公司；PKH67购于德国默克公司，Annexin-V/ Propidium Iodide试剂盒购自广州康众生物有限公司，RPMI1640和胎牛血清购自广州益龙科技有限公司。共聚焦显微镜(德国莱卡公司)，H-7600电子显微镜(日本日立)。2%磷钨酸购自美国Sigma，TRIzol LS试剂(Invitrogen，CA，USA)。

1.2 细胞培养与外泌体的提取

人源性胶质瘤细胞U251或人星型胶质细胞置于RPMI 1640 培养基中常规培养，添加青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml降低细胞污染，设定培养箱参数为37 ℃、95%饱和湿度，5% CO培养箱，每2～3天更换1次培养基，常规培养细胞72 h后，提取细胞上清液，4 ℃下完成离心操作，依次275 r/min离心8～10 min，提取离心管内上清液，1 836 r/min离心15 min，提取离心管内上清液，3 000 r/min离心30 min，用0.22 μm滤器过滤后，24 000 r/min离心60 min，去除离心管内上清液，用1 ml PBS吹打混匀管底，冻存于-80 ℃冰箱。

1.3 透射电镜观察外泌体形态

外体重悬液置于涂有碳涂层的300网铜网格上，然后在室温下干燥5 min，用2%磷钨酸滴染色10 min。采用H-7600电子显微镜观察样品形态，纳米颗粒跟踪分析(NTA)评估分离的外泌体直径分布。

1.4 Western blot

实验设U251细胞外泌体组和U251细胞去外泌体上清液组(对照组)，总蛋白提取后，用SDS-PAGE将等载量的提取蛋白分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜3 h，然后依次加入CD9、CD63和β-actin蛋白抗体(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后滴加二抗(1 ∶2 000)，室温下温育2 h。滴加化学发光试剂(ECL)2 min，使用Chemi DocMP显现。

1.5 免疫荧光染色

细胞PBS冲洗后，依次加入多聚甲醛溶液固定，0.1% Tirton X-100，BSA溶液封闭，按预设时间间隔加入PKH67荧光标记(绿色)(1 ∶100稀释)，phalloidin抗体(1 ∶100稀释)，U251细胞外泌体采用PKH67荧光标记(绿色)，U251细胞质用phalloidin染色，避光条件下孵育1 h，DAPI染核3 min，PBS冲洗后取出细胞爬片，封片，荧光显微镜下观察。运用激光共聚焦显微镜采集图像。图像采用Image Pro软件分析。

1.6 细胞增殖活力检测

取处于对数生长期细胞，配置密度为1×10/ml细胞悬液，于96孔板中每孔加入单细胞悬液100 μl，空白孔加入等量的培养基，置于37 ℃、恒定饱和湿度、 5% CO培养箱中孵育，分别于培养第0、24、48、72及96 小时加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育3～4 h后，置于酶标仪用450 nm单波长测吸光度值(OD值)，实验重复3次，绘制细胞生长曲线。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞，以2×10个/孔接种在6孔板上。按实验设计分组培养后胰酶消化收集处理，PBS清洗后70%冷乙醇固定，离心洗涤后采用Annexin-V/ Propidium Iodide试剂盒检测细胞凋亡比例。

1.8 MiRNAs基因筛选

选择国内外文献报道，已通过miRNAs基因芯片证实与U251胶质瘤细胞增殖凋亡相关20个miRNAs作为筛选目标：miR-4726-5p、miR -1255b-2-3p、miR -340-5p、miR -4275、miR -4712-3p、miR -576-5p、miR -1299、miR -4268、miR -3591-5p、miR -626、miR -3169、miR-374a、miR-590-3p、miR-374b、miR-29c、miR-125b、miR-221、miR-10a、miR-32和miR-138。

1.9 MiR-125b NC、mimics、inhibitor质粒转染

实验分对照组：转染阴性对照组(negative control，NC)、miR-125b mimics组和miR-inhibitor组。miR-125b NC、mimics和inhibitor质粒载体由上海吉玛生物制药有限公司构建，将质粒载体转染后，采用胰酶收集细胞，重悬沉淀后用细胞培养液将细胞密度调至5×10个/ml，接种于6孔板中培养。

1.10 RT-PCR

参照TRIzol试剂说明书操作提取细胞总RNA，鉴定RNA浓度及纯度。采用RT-PCR试剂盒，按照上面反应体系进行cDNA的合成逆转录反应体系。ABI Prism7500型荧光定量 PCR仪中扩增，以内参U6进行标准化，采用2法计算基因的相对表达量。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞源性外泌体的鉴定

透射电子显微镜结果显示：胶质瘤U251细胞上清液提取出外泌体颗粒具有双侧膜结构(图1A)，纳米颗粒跟踪分析显示：外泌体的尺寸分布约为100 nm直径(图1B)。Western blot显示：外泌体组特异性外泌体标记蛋白CD9和CD63含量高于对照组(去外泌体细胞上清液)(图1C)。结果表明，外泌体成功地从细胞上清液中分离出来。

图1 胶质瘤细胞源性外泌体的鉴定A：电镜下外泌体形态(×50 000，红色箭头)；B：外泌体径粒分析；C：外泌体标志性蛋白CD63和CD9表达量

2.2 U251细胞摄取外泌体情况

在U251细胞培养基中分别加入浓度为100 μg/ml的外泌体悬液30 μl(外泌体组)或等量不含外泌体培养基(对照组)，共聚焦荧光显微镜结果显示：外泌体组U251细胞内可见PKH67荧光标记，对照组(细胞上清液)细胞内未见PKH67荧光标记(图2)。

图2 荧光显微镜下U251细胞摄取外泌体情况 ×400DAPI：U251细胞核；PKH67：外泌体；FITC-phalloidin：U251细胞质；Merge：合图

2.3 外泌体影响U251细胞增殖凋亡

分别将外泌体悬液30 μl(浓度为100 μg/ml)或无外泌体培养基30 μl(对照组)加入U251细胞共培养，流式细胞术结果显示：外泌体组细胞凋亡比例为(6.03±0.15)%，低于对照组(18.34±4.07)%(

t

=17.207，

P

<0.01)(图3A)。CCK-8结果显示：外泌体组细胞增殖活性在72 h(

t

=9.398，

P

<0.01)及96 h(

t

=6.025，

P

<0.01)时间点高于对照组对应时间点(图3B)，差异有统计学意义(

P

<0.05)。

图3 外泌体对U251细胞增殖凋亡的影响A：流式细胞法检测细胞凋亡(Q2+Q3)比例；B：CCK-8检测细胞在450 nm处吸光度值，与对照组比较：*P<0.05

2.4 胶质瘤细胞源性外泌体内miRNA的鉴定

按“1.8项下方法”选择的20个miRNAs，RT-PCR结果显示：U251细胞外泌体中miR-125b、miR-221、miR-374a、miR-138和 miR-4712等含量高于人星型胶质细胞外泌体。其中miR-125b倍数差异性最高(图4)，差异有统计学意义(

t

=38.322，

P

<0.01)。

图4 RT-PCR检测miRNAs相对表达量与人星型胶质细胞外泌体比较：*P<0.05

2.5 外泌体通过miR-125b调控胶质瘤细胞的增殖凋亡

分别将miR-NC、miR-125b mimics或miR-125b inhibitor转染U251细胞后提取外泌体，RT-PCR结果显示：miR-NC组外泌体miR-125b水平高于miR-125b inhibitor组(

t

=2.533，

P

=0.039)，低于miR-125b mimics组(

t

=21.103，

P

<0.01)(图5A)。将提取的外泌体与U251细胞共培养，CCK-8结果显示：在72 h及96 h时间点，miR-NC组细胞增殖活性低于miR-125b mimics组(72 h，

t

=2.486，

P

=0.038)(96 h，

t

=2.636，

P

=0.030)，高于miR-125b inhibitor组(72 h，

t

=2.938，

P

=0.028)(96 h，

t

=2.815，

P

=0.021)(图5B)。流式细胞术结果显示miR-NC组细胞凋亡比例为(14.33±3.06)%，高于miR-125b mimics组(7.12±1.27)%(

t

=4.132，

P

=0.003)，低于miR-125b inhibitor组(32.75±5.41)%，差异均有统计学意义(

t

=6.198，

P

<0.01)(图5C)。

图5 外泌体通过miR-125b调控胶质瘤细胞的增殖凋亡A：RT-PCR检测miR-125b相对表达量，与miR-NC组比较：*P<0.05，**P<0.01；B：CCK-8检测细胞在450 nm处吸光度值，与miR-125b mimics比较：*P<0.05；与miR-125b inhibitor组比较：#P<0.05；C：流式细胞法检测细胞凋亡(Q2+Q3)比例

3 讨论

研究发现，外泌体是细胞外囊泡的常见类型，可作为蛋白质、RNAs和其他生物活性分子载体，参与胶质瘤细胞间的信号传导，进而改变受体细胞的增殖、凋亡等。Spinelli et al发现人内皮细胞外泌体通过干扰胶质瘤干细胞的增殖及分化，促使胶质瘤干细胞保持多向分化能力及肿瘤特性。Hao et al发现星型胶质瘤细胞外泌体通过抑制受体细胞PTEN蛋白，促进肿瘤细胞增殖，减少细胞自然状态下的凋亡比例。此外，Zhou et al总结指出，巨噬细胞、星型细胞等，均可通过外泌体完成细胞间的信号传导，触发反馈循环通路。本研究中发现，将胶质瘤细胞外泌体与肿瘤细胞共培养后，可增加细胞增殖活性；流式细胞术发现，外泌体与U251细胞共培养后，细胞晚期凋亡比例明显降低，提示外泌体可调控细胞增殖凋亡活性。

在胶质瘤细胞微环境中，外泌体miRNAs是多种生理和病理条件下的细胞调节因子，通过激活和(或)抑制不同的信号通路，在胶质瘤增殖凋亡过程中发挥重要作用。如Yue et al提出，低氧条件下胶质瘤细胞外泌体通过miR-301a，靶向抑癌基因转录延伸因子A样蛋白7，激活Wnt/catenin信号通路，调控胶质母细胞瘤的增殖活性。Yang et al发现胶质瘤细胞外泌体可通过miR-221，抑制受体细胞发动蛋白(DNM3)，促进细胞增殖。本研究对比人星型胶质细胞外泌体与胶质瘤细胞外泌体发现，多个miRNAs出现差异性表达，如miR-125b、miR-221、miR-10a、miR-32等，提示外泌体可根据细胞源性不同，调整RNAs转录。但同时也发现，PCR结果与以往文献报道存在差异性，推测其可能原因是：miRNAs必须通过RNA结合蛋白RBPs运输到多囊泡体，最终装载到外泌体并从质膜分泌。在不同细胞源性及微环境下，外泌体中Argonaute 2蛋白的缺失程度不同，或外泌体miRNAs降解程度不一，均可导致miRNAs水平出现差异性变化。

研究发现，miR-125b在多个肿瘤细胞中表达含量明显升高，其对应的靶基因众多，覆盖细胞增殖、分化、迁移、凋亡、细胞周期和耐药等，但其作用存在差异性。如Zheng et al发现急性淋巴细胞白血病和低分化非小细胞肺癌中，miR-125b作为肿瘤增殖和细胞周期调控的抑制因子，通过调控NF-κB信号通路发挥作用。而Huang et al在胶质瘤细胞中发现，miR-125b的上调可激活Wnt通路，同时促进STAT3和NF-κB信号通路活性。此外，神经氨酸酶1、DRAM2、P53和P38均是miR-125b的直接靶点，miR-125b对下游靶基因的抑制程度直接影响细胞增殖活性。在本研究中，外泌体内miR-125b含量较高，明显高于其他RNAs，将外泌体悬液与miR-125b inhibitor共同加入细胞共培养后，可逆转外泌体对细胞增殖凋亡的影响，提示外泌体对胶质瘤细胞增殖凋亡的调控作用，主要依赖miR-125b。此外，本研究中，miR-125b促进胶质瘤细胞增殖，抑制凋亡，推测miR-125b可能通过P53和P38蛋白发挥作用。

本研究的局限性在于仅在U251细胞株进行验证，在其他胶质瘤细胞株中的结果尚未证实；此外，外泌体是否可通过长链非编码RNA、mRNAs或蛋白质等发挥作用仍需要进一步论证。