基于16S rDNA测序技术分析异烟肼致大鼠肝损伤中肠道菌群变化特征

吴冬雪，李玉红，裴盛斐，王 林，杨璐铭，张 咪，王 雪，朱晗瑀，郝金奇，冯福民,5

异烟肼(isoniazid，INH)是世界卫生组织和国际防痨与肺病联合会推荐的一线抗结核药物之一，但长期使用可能会引起多种不良反应，其中最严重的副作用是抗结核药物性肝损伤(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ADLI)，其是导致结核病复发和产生耐药性的重要原因之一。

肠道菌群被誉为人类“第二基因组”，与人体健康息息相关。正常情况下，肠道菌群处于相对稳定状态，能够维持肠道屏障的完整性，抵御病原微生物的入侵，而大量服用抗生素类药物则会导致肠道菌群紊乱。已有研究表明肠道菌群与对乙酰氨基酚、他克林等药物导致的肝损伤之间存在联系，但是关于肠道菌群与ADLI之间的关系研究尚属空白。该研究应用16S rDNA测序技术分析INH致ADLI大鼠肝损伤模型中肠道菌群的变化情况。

1 材料与方法

1.1 研究材料

SPF级6～8周龄雄性SD大鼠24只，体质量180～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于华北理工大学实验动物中心清洁动物房，大鼠自由进食与饮水，交替照明各12 h，温度24 ℃左右，相对湿度60%～80%。INH购自沈阳红旗制药有限公司(批号：140402)。本研究已获华北理工大学动物伦理委员会审查批准(批文号：LX2018137)。

1.2 动物分组

24只SD雄性大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组(D0组，

n

=8)、INH灌胃10 d组(H10组，

n

=8)、INH灌胃28 d组(H28组，

n

=8)。D0组于实验开始0 d处死，H10组和H28组给予50 mg/(kg·d)灌胃，分别于连续灌胃10 d和28 d后处死各组所有大鼠。

1.3 标本采集

大鼠处死后取部分肝组织，经10%福尔马林固定、脱水、包埋获得4 μm厚度切片，HE染色后，置于光学显微镜下观察肝组织病理改变。

末次给药24 h后，收集大鼠新鲜粪便颗粒于5 ml无菌冻存管中，置于-80 ℃保存。

1.4 16S rDNA测序

每组使用随机数字表法随机选取4只大鼠的粪便标本送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序。

1.5 肠道菌群测序结果分析

α多样性分析采用Sobs指数和Shannon指数；β多样性分析采用主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，使用相似性分析(analysis of similarities，Anosim)评估组间差异；分别从门和属水平比较各组大鼠肠道菌群组成。

1.6 生物信息学分析

Heatmap图以颜色梯度来呈现物种组成及丰度信息。根据样本间丰度的相似性进行聚类，可使高、低丰度的物种分块聚集，通过颜色变化反映各组在属水平上群落组成的相似性和差异性。

1.7 统计学处理

使用STAMP和R软件进行组间差异分析。STAMP软件中的ANOVA检验和R stats包中的Kruskal-Wallis秩和检验用于多组间差异分析，Wilcoxon秩和检验用于两组间差异分析。非正态分布的数据采用

M

(

P

,

P

)表示。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠肝组织病理学结果

D0组肝细胞以小叶中央静脉为中心呈放射状整齐排列，无明显水肿或炎症改变；H10组肝组织中部分区域出现肝细胞胞浆疏松化和气球样变，伴有点状坏死；H28组可见肝小叶结构和肝索完全破坏，出现明显桥接样坏死，大面积肝细胞溶解性坏死(图1)。

图1 三组大鼠肝组织病理学光镜图 HE×200A：D0组；B：H10组；C：H28组

2.2 实验大鼠菌群测序稀释曲线分析

测序样本的微生物群落Sobs指数和Shannon指数稀释曲线趋向平坦，说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种(图2)。

图2 肠道菌群测序的稀释曲线A：Sobs指数；B：Shannon指数

2.3 实验大鼠肠道菌群α多样性分析

α多样性反映微生物群落的丰富度和多样性。结果显示，各组Sobs和Shannon指数均差异无统计学意义(

P

>0.05)(图3)。说明在INH致大鼠肝损伤过程中肠道菌群的丰富度和多样性未发生改变。

图3 三组大鼠肠道菌群的α多样性A：Sobs指数；B：Shannon指数

2.4 实验大鼠肠道菌群β多样性分析

β多样性分析反映样本群落组成的相似性。PCoA图和Adonis分析显示，各组组内样本呈现聚集倾向，而组间样本坐标均能分开，表明三组大鼠组内菌群结构相似，组间菌群结构存在差异(

R

=0.432,

P

=0.001)(图4)。图4中样本距离越远，菌群结构差异越大；

R

表示分组对样本差异的解释度，

R

值越大，表示分组对差异的解释度越高。说明给予大鼠INH药物灌胃10 d和28 d分别不同程度地改变了大鼠肠道菌群结构。

图4 三组大鼠肠道菌群的PCoA图

2.5 实验大鼠肠道菌群物种组成分析

在门水平上，三组大鼠粪便菌群均主要由6个门构成。Firmicutes和Bacteroidetes占总细菌的85%以上，是绝对优势菌。Kruskal-Wallis检验结果显示，Actinobacteria、Verrucomicrobia、Patescibacteria和Tenericutes的丰度变化在三组之间有差异。与D0组比较，给予INH可导致Tenericutes丰度增加，Verrucomicrobia丰度减少，Actinobacteria和Patescibacteria丰度先增加后减少(均

P

<0.05)。进一步进行两两比较发现，与D0组比较，H10组各个门的丰度无明显改变，而H28组Actinobacteria、Verrucomicrobia和Patescibacteria的丰度减少，Tenericutes的丰度增加；与H10组比较，H28组Actinobacteria和Patescibacteria的丰度减少(均

P

<0.05)(图5)。

图5 三组大鼠肠道菌群在门水平的组成及差异分析A：三组大鼠肠道菌群在门水平的物种组成；B：三组大鼠肠道菌群的菌门差异比较；C：D0组和H28组的菌门差异比较；D：H10组和H28组的菌门差异比较

在属水平上，三组大鼠粪便菌群均主要由22个属构成。Kruskal-Wallis检验结果显示，共有12个属的相对丰度变化在三组间有统计学差异。与D0组比较，给予INH药物可导致Ruminococcaceae_UCG-005、Dubosiella、norank_f__norank_o__Mollicutes_RF39、unclassified_f__Ruminococcaceae、Roseburia、Blautia丰度增加，Lactobacillus、Romboutsia、Akkermansia丰度减少，Bifidobacterium、Candidatus_Saccharimonas丰度先增加后减少，Ruminococcus_1丰度先减少后增加(均

P

<0.05)。进一步进行两两比较发现，与D0组比较，H10组Roseburia和Dubosiella的丰度分别减少和增加，H28组Lactobacillus、Romboutsia和Akkermansia减少，Ruminococcaceae_UCG-005、norank_f__norank_o__Mollicutes_RF39、unclassified_f__Ruminococcaceae、Roseburia和Blautia增加；与H10组比较，H28组Lactobacillus、Bifidobacterium和Candidatus_Saccharimonas丰度减少，Ruminococcus_1和Blautia丰度增加(图6)。基于属水平的Heatmap分析与上述结果一致(图7)。

图6 三组大鼠肠道菌群在属水平的组成及差异分析A：三组大鼠肠道菌群在属水平的物种组成；B：三组大鼠肠道菌群的菌属差异比较；C：D0组和H10组的菌属差异比较；D：H10组和H28组的菌属差异比较；E：D0组和H28组的菌属差异比较

图7 三组大鼠肠道菌群在属水平的Heatmap分析

3 讨论

研究采用16S rDNA测序技术初步探索了INH致大鼠ADLI时肠道菌群的变化特征，发现大鼠肠道菌群的丰富度和多样性未发生改变，而肠道菌群结构和组成却发生变化。

物种组成分析发现，INH灌胃10 d和28 d后，Verrucomicrobia丰度减少，而Tenericutes丰度增加，但各组大鼠肠道中的绝对优势菌Firmicutes和Bacteroidetes未发生明显改变。说明在INH致大鼠ADLI时，不影响肠道优势菌的种类，但对其组成比例有一定影响。在属水平上，大鼠肠道中的一些有益共生菌属含量减少，如Lactobacillus、Romboutsia和Akkermansia。Lactobacillus作为人体肠道正常菌群之一，已被发现在不同肝病中均有潜在的预防和治疗价值，如补充鼠李糖乳杆菌可保护肝脏免受对乙酰氨基酚过量和急性乙醇中毒导致的氧化性损伤。Romboutsia归属于Firmicutes，是常见的肠道细菌，参与机体能量代谢，与肝脏损伤密切相关。Akkermansia是一种很有前景的益生菌，可以治疗性改善酒精性肝病引起的肝损伤，也可预防性减少乙醇诱导肝损伤和脂肪变性。本研究中，INH致大鼠ADLI时，丰度增加的菌属大部分归属于厚壁菌门的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae，具有次级胆汁酸生成能力。Ma et al发现次级胆汁酸可通过抑制CXC趋化因子配体16蛋白抑制自然杀伤T细胞的激活来促进肝肿瘤的发生。也就是说，肠道菌群可以通过调节次级胆汁酸的生成调控肝脏中的免疫细胞影响疾病进程。

本研究利用动物模型首次证明了肠道菌群与ADLI之间存在紧密联系，分析了INH致大鼠ADLI时肠道菌群的变化特征。但由于肠道微生物的组成结构复杂，肠道菌群与ADLI之间的因果关系及具体作用机制还需要进一步研究。