新生期小鼠七氟醚暴露对其青春期学习记忆及海马组织髓鞘损伤的影响

张 意，杨志来，张继千，刘学胜

全球每年有数百万儿童在全麻下接受手术治疗，但全麻药物对儿童中枢神经系统的影响尚不明确。2016年FDA提出，3岁以下儿童和孕晚期孕妇，长时间或多次全麻药物和镇静剂暴露可能会影响儿童的大脑发育，中枢神经系统髓鞘在学习及记忆中扮演重要角色，可能参与该过程。挥发性全麻药物七氟醚可通过抑制海马GSK3β/β-catenin信号通路中GSK3β的Ser9位点磷酸化进而损害成年大鼠记忆巩固，该信号通路在髓鞘基因表达过程中发挥关键作用。该研究拟建立新生期小鼠多次七氟醚暴露模型，探究七氟醚暴露对小鼠海马组织髓鞘损伤及青春期学习记忆功能的影响，并初步揭示GSK3β/β-catenin信号通路在其中的作用，为临床儿童麻醉管理提供指导，降低七氟醚对儿童中枢神经系统的不良影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级8～10周C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克生物有限公司，6日龄小鼠由繁殖获得。动物生产许可证号：SCXK(沪)2017 - 0005。饲养条件为SPF级环境，温度为(23±3) ℃，湿度为40%～70%，12 h/12 h明暗交替，自由饮水、摄食。

1.2 主要试剂与仪器

七氟醚(批号：20120931)购自上海恒瑞医药有限公司；氯化锂(批号：310468)购自美国Sigma公司；MBP抗体(批号：10458-1-AP)购自Proteintech公司；pGSK3β抗体(批号：5558)、GSK3β抗体(批号：9327)、β-catenin抗体(批号：8480)购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体(批号：8226)购自英国Abcam公司。七氟醚挥发罐购自德国Drager公司。

1.3 分组与处理方法

6日龄C57BL/6小鼠随机分成4组，即对照组(CON组)、七氟醚组(SEVO组)、对照+氯化锂组(LiCl组)、七氟醚+氯化锂组(SEVO+LiCl组)。分子生物学实验，每组小鼠5只，新物体识别实验，每组小鼠15只，Y迷宫实验，每组小鼠15只。SEVO组为3%七氟醚连续暴露3 d(第6～8天)，每天1次，每次2 h，CON组为60%氧气对照，LiCl组为60%氧气暴露前30 min腹腔注射GSK3β抑制剂氯化锂(100 mg/kg)，SEVO+LiCl组为七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化锂(100 mg/kg)，CON组与SEVO组小鼠腹腔注射等量生理盐水。第8天麻醉结束后取海马组织进行分子生物学检测。第30～32天进行新物体识别实验及Y迷宫实验。根据既往研究，在七氟醚暴露期间，60%氧气可以使小鼠体内维持足够氧分压，本研究中，60%氧气与40%氮气混合作为载气。监测七氟醚、氧气和二氧化碳浓度。采用保温装置，使小鼠体温维持在(37±0.5) ℃。氯化锂溶液由氯化锂粉末溶于0.9%无菌生理盐水配置而成。

1.4 新物体识别实验

实验设计包含3个阶段，即适应阶段、获取阶段、测试阶段。适应阶段为在没有任何物体的环境中适应10 min,然后将小鼠放回原先饲养笼；获取阶段为适应结束24 h，在原先适应的环境中放置两个相同的物体(A+A)探索10 min，分别记录探索两个物体A的次数；测试阶段为获取结束后24 h，将环境中的一个物体A置换成另一个新的物体B,分别记录探索物体A和物体B的次数。采用新物体识别实验识别指数来评估海马依赖的学习记忆功能。识别指数=(探索物体B次数-探索物体A次数)/(探索物体B次数+探索物体A次数)。

1.5 Y迷宫实验

Y迷宫装置由平行于水平面的3个臂组成，即起始臂、其它臂和新臂，相邻两臂之间夹角为120°。实验设计包含2个阶段，即获取阶段和测试阶段。获取阶段封闭新臂入口，允许小鼠在起始臂和其它臂之间探索10 min，分别记录进入起始臂和其它臂的次数。间隔2 h进入测试阶段，该阶段为Y迷宫装置的3个臂均开放，将小鼠由起始臂放入，记录5 min内进入新臂的次数和进入3个臂的总次数。采用Y迷宫实验新臂探索次数百分比来评估海马依赖的学习记忆功能。新臂探索次数百分比=( 新臂探索次数/3个臂总探索次数)×100%。

1.6 Western blot实验

取小鼠海马组织，加入组织裂解液RIPA及蛋白酶抑制剂PMSF，冰上超声碎解后离心取上清液，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。上样到13.5% SDS-PAGE凝胶中电泳分离蛋白，电泳后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗MBP(1 ∶1 000)、pGSK3β(1 ∶1 000)、GSK3β(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤，用标记辣根过氧化物酶的二抗室温摇床孵育1 h，ECL显影液观察。在全自动凝胶成像系统中曝光显影，并用Image J软件统计灰度值，计算相对表达量。

2 结果

2.1 新生期小鼠七氟醚暴露致青春期学习记忆功能受损

通过新物体识别实验和Y迷宫实验，评估小鼠出生后早期七氟醚暴露导致的青春期学习记忆功能损伤。在新物体识别实验中，与CON组(0.21±0.10)比较，SEVO组(0.10±0.07)小鼠识别指数明显降低，差异有统计学意义(

t

=3.156 ,

P

<0.05)，见图1A。在Y迷宫实验中，与CON组(47.01±3.40)% 比较，SEVO组(32.15±5.49)% 小鼠新臂探索次数百分比降低，差异有统计学意义(

t

=7.718 ,

P

<0.05)，见图1B。

图1 新生期小鼠3%七氟醚多次暴露对其青春期学习记忆能力影响A:新物体识别实验检测两组小鼠第30～32天时识别指数；B:Y迷宫实验检测两组小鼠第30～32天时新臂探索次数百分比；与CON组比较 ：*P<0.05

2.2 新生期小鼠七氟醚暴露导致海马组织髓鞘损伤

Western blot检测小鼠海马组织髓鞘相关蛋白MBP表达及GSK3β/β-catenin信号通路蛋白变化。与CON组比较，SEVO组小鼠海马组织MBP蛋白、β-catenin蛋白表达降低，pGSK3β/GSK3β比值降低，差异有统计学意义(MBP:

t

=4.692；pGSK3β/GSK3β:

t

=3.381;β-catenin:

t

=2.993,均

P

<0.05)，见图2A～F。

图2 新生期小鼠3%七氟醚多次暴露后小鼠海马组织中MBP蛋白表达、pGSK3β/GSK3β比值、β-catenin蛋白表达变化A:MBP和β-actin的免疫印迹条带；B:MBP蛋白灰度值标准化后的统计结果；C:pGSK3β和GSK3β的免疫印迹条带；D:pGSK3β蛋白和GSK3β蛋白灰度值比值标准化后的统计结果；E:β-catenin和β-actin的免疫印迹条带; F:β-catenin蛋白灰度值标准化后的统计结果;与CON组比较 ：*P<0.05

2.3 七氟醚可能通过抑制海马GSK3β/β-catenin信号通路中GSK3β磷酸化引起新生期小鼠七氟醚暴露后的海马组织髓鞘损伤

Western blot结果表明，与SEVO组比较，SEVO+LiCl组小鼠海马组织MBP蛋白、β-catenin蛋白表达增加，pGSK3β/GSK3β比值升高，差异有统计学意义(MBP:

F

=6.589; pGSK3β/GSK3β:

F

=9.898;β-catenin:

F

=8.122,均

P

<0.05)，见图3A～F。

图3 七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化锂后对小鼠海马组织中MBP蛋白表达、pGSK3β/GSK3β比值、β-catenin蛋白表达变化A:MBP和β-actin的免疫印迹条带；B:MBP蛋白灰度值标准化后的统计结果；C:pGSK3β和GSK3β的免疫印迹条带；D:pGSK3β蛋白和GSK3β蛋白灰度值比值标准化后的统计结果；E:β-catenin和β-actin的免疫印迹条带;F:β-catenin蛋白灰度值标准化后的统计结果;1：CON组；2：SEVO组；3：LiCl组；4：SEVO+LiCl组；与CON组比较：*P<0.05 ；与SEVO组比较：#P<0.05

2.4 氯化锂减轻新生期小鼠七氟醚暴露后的学习记忆功能损伤

新物体识别实验结果显示，与SEVO组(0.08±0.07)比较，SEVO+LiCl组(0.23±0.11)小鼠识别指数升高，差异有统计学意义(

F

=6.921，

P

<0.05)，见图4A。Y迷宫实验结果显示，与SEVO组(33.63±6.39)%比较，SEVO+LiCl组(45.03±3.55)%小鼠新臂探索次数百分比升高，差异有统计学意义(

F

=24.816，

P

<0.05)，见图4B。

图4 七氟醚暴露前30 min腹腔注射氯化锂后对小鼠青春期学习记忆能力影响A:新物体识别实验检测四组小鼠第30～32天时识别指数；B:Y迷宫实验检测两组小鼠第30～32天时新臂探索次数百分比；1：CON组；2：SEVO组；3：LiCl组；4：SEVO+LiCl组；与CON组比较：*P<0.05 ；与SEVO组比较：#P<0.05

3 讨论

七氟醚具有刺激小、诱导平稳、苏醒快等优点，广泛应用于临床儿科手术中，但其对儿童神经系统是否有影响目前还存在争议。2019年《柳叶刀》杂志上发表了一项关于全麻药物神经发育毒性的前瞻性随机对照研究(GAS研究)，结果显示接受短时间七氟醚麻醉与接受局部麻醉的幼儿比较，在2岁和5岁时的智商分数及其他神经认知功能无显著差异。近期，PANDA、MASK两项关于全麻药物神经发育毒性的临床回顾性研究表明，婴幼儿早期短暂接触全麻药物对神经系统的发育无明显影响，但多次全麻药物暴露会降低运动协调能力。基于临床研究中发现的不同结果，全麻药物对中枢神经系统的影响有待进一步的探索。大量动物研究表明，幼鼠多次全麻药物暴露会导致后期认知功能障碍，其机制可能与神经元凋亡、再生抑制及突触功能障碍有关。本研究在动物水平上分析了七氟醚对小鼠学习记忆功能的影响。为模拟临床儿童麻醉暴露，选择出生后第6～8天七氟烷暴露，第30～32天检测小鼠的学习记忆功能。采用的是目前广泛应用于动物海马依赖认知功能分析的新物体识别实验和Y迷宫实验。与CON组比较，SEVO组小鼠识别指数下降、新臂探索次数百分比降低，表明小鼠学习记忆功能受损，该结果与此前发表的研究结果一致。

中枢神经系统髓鞘在学习和记忆中发挥重要作用，且髓鞘易受外界影响。Zhang et al提出七氟醚通过增加非灵长类动物和啮齿动物髓鞘发育相关基因ERMN启动子区甲基化水平，造成发育中的幼鼠大脑叶酸代谢紊乱引起髓鞘损伤，最终导致小鼠认知功能障碍，该研究提示髓鞘损伤可能是全麻药物神经毒性的机制之一。近期有研究表明海马组织的髓鞘损伤与认知功能损害有关。而本研究Western blot结果显示，与CON组比较，SEVO组小鼠海马组织髓鞘碱性蛋白MBP降低，新物体识别指数下降，新臂探索次数百分比降低，表明七氟醚暴露后小鼠海马组织存在髓鞘损伤及学习记忆功能损害。

本课题组前期研究表明七氟醚可抑制成年大鼠海马GSK3β/β-catenin信号通路中GSK3β的磷酸化。GSK3β/β-catenin信号通路在髓鞘基因表达和髓鞘发生过程发挥重要作用。本研究结果显示，新生期小鼠七氟醚暴露可以抑制海马组织GSK3β的磷酸化。与CON组比较，SEVO组小鼠pGSK3β/GSK3β比值降低，引起下游β-catenin蛋白表达下降。采用GSK3β抑制剂氯化锂预处理后，小鼠海马组织pGSK3β/GSK3β比值升高，逆转GSK3β/β-catenin信号通路中GSK3β磷酸化的抑制，小鼠海马组织髓鞘蛋白MBP及β-catenin蛋白表达增加。行为学结果也表明，SEVO+LiCl组小鼠识别指数和新臂探索次数百分比增加，相对于SEVO组小鼠学习记忆功能有所好转。

综上所述，新生期小鼠多次七氟醚暴露后，GSK3β/β-catenin信号通路中的GSK3β磷酸化受到抑制，导致海马组织髓鞘损伤，引起青春期的学习记忆功能损伤，通过氯化锂预处理，减轻七氟醚对儿童中枢神经系统的毒副作用，为临床儿童麻醉提供指导。