猪烧伤创面渗出液蛋白质组学及创面修复过程中蛋白水解动态变化研究

高 兵，韩志芬，曲 滨，李 巍，杜广刚

烧伤创面愈合是一个动态和复杂的过程，涉及损伤区周围的各种介质和多种细胞类型。关于烧伤创面愈合、瘢痕形成细胞和分子机制仍然知之甚少，因此，寻找可能改善身体的自然修复机制的临床策略将需要基于对修复和再生的基本生物学的透彻理解。烧伤创面渗出液代表着烧伤创面的微环境，从中提取与细胞组分、信号传导和蛋白质等相关信息有助于判断烧伤损害程度、创面深度和可能的全身并发症。由于创面渗出液影响创面愈合及创基生理，现在新的治疗方法正在向改善创面渗出液转变。此外，研究证实烧伤创面渗出液与瘢痕形成有关。目前已知的烧伤创面渗出液分子生物学相关知识还知之甚少，我们推测对烧伤渗出液的研究可能与烧伤创面愈合、瘢痕形成、烧伤创面转变和烧伤创面深度判断的机制关联密切。近年来，蛋白质组学的应用改变了探寻指示创面愈合以及对治疗的反应标志物。基于此，该研究利用末端胺底物同位素标记技术(terminal amine isotopic labeling of substrates，TAILS)评估创面愈合渗出液蛋白水解事件，通过同位素标记相对或绝对定量技术(isobarictag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)定量分析烧伤创面愈合不同时期创面渗出液蛋白质和蛋白N端动态变化，旨在为判断烧伤患者创面愈合情况提供新的临床检验方法。

1 材料与方法

1.1 体猪创面模型制备及渗出液提取

西藏小型猪8头，雄性，体质量10～15 kg，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供[许可证号：SCXK(川)2009-09]，实验前在四川省人民医院动物饲养室饲养1周。随机分为4组，每组2头：伤后第0～2天(2 d)、第2～4天(4 d)、第4～6天(6 d)、第6～8天(8 d)。动物经氯胺酮、速眠新麻醉后双侧背部备皮，在背部中线两侧平行线上用固体酒精燃烧30 s制作4组5 cm大小深二度皮肤烧伤创面。将环氧乙烷灭菌的泡沫敷料切成适当的尺寸并置于创面内。创面用黏性聚氨酯膜密封，中心穿1 cm孔，连接引流管系统，在真空装置帮助下施加125 mmHg的负压。在第2、4、6、8天取出泡沫，储存在-80 ℃用于蛋白质组学分析。对于4、6、8 d创面，分别在伤后第2、4、6天更换泡沫。从泡沫中提取创面渗出液：将用创面液浸泡的冷藏泡沫置于用塑料塞密封的2 ml注射器中，并在1～2 ml提取缓冲液[50 mmol/L HEPES，pH 7.8，10 mmol/L EDTA 蛋白酶抑制剂(德国Roche公司)]在4 ℃下在旋转器上培养1～3 h。随后，取出塞子，用注射器转移至15 ml Falcon管中，通过离心(7 min，250 r/min，4 ℃)收集创面液。通过第2次离心(10 min，15 000 r/min，4 ℃)除去不溶性颗粒，将提取的创面渗出液储存在-80 ℃。

1.2 创面渗出液的加工和蛋白质量的平衡

汇集来自同一猪的创面渗出液，将缓冲液更换为50 mmol/L HEPES，pH 7.8，利用5 kDa分子量截留浓缩器(德国Vivaspin公司)通过超滤除去低分子量组分。通过离心(10 min，15 000 r/min，4 ℃)除去固体颗粒，Bradford分析法测定蛋白质浓度(美国BioRad公司)，样品直接进一步处理或储存在-80 ℃。用组合肽配体库技术平衡蛋白质量，使用ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit(BioRad)处理样品。将创面渗出液样品调节至在50 mmol/L HEPES，pH 7.8中的50～70 mg/ml的蛋白质浓度，并装载到ProteoMiner离心柱上。根据制造商的说明书进行柱制备、样品结合、洗涤和洗脱。与肽配体文库结合的蛋白质在300 μl洗脱缓冲液(8 mol/L尿素，2% CHAPS)中洗脱，并通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。加工的样品在300 μl中含有0.95～2.00 mg总蛋白质。最后，如上所述通过超滤将ProteoMiner处理的样品缓冲交换为250 mmol/L HEPES(pH 7.8)和2.5 mol/L盐酸胍，重新评估蛋白质浓度，用相同缓冲液调节至1 mg/ml，并储存在-80 ℃备用。

1.3 4plex-iTRAQ-TAILS方法

根据实验手册进行iTRAQ-TAILS分析。将0.5 mg处理的创面渗出液的等分试样以1 ∶4的蛋白/ iTRAQ(w/w)比例用4plex-iTRAQ试剂标记。样品用胰蛋白酶Trypsin(美国Promega公司)和1/10的肽混合物用于在N-末端富集之前进行分析。将435 kDa的HPG-ALD聚合物以3倍过量(w/w)以在先前描述的条件下耗尽剩余样品的内部胰蛋白酶肽(TAILS)。将样品冷冻并储存在-20 ℃备用。

1.4 强阳离子交换色谱和质谱分析

在进行质谱分析之前，将肽段加载到1100 HPLC系统(美国Agilent Technologies公司)上并通过200 Poly PolySULFOETHYL A强阳离子交换色谱柱(200 mm×2.1 mm，5 μm，美国PolyLC Inc公司)进行分馏。用100%缓冲液A(10 mmol/L磷酸钾，25%乙腈，pH 2.7)洗脱60 min，然后在5 min内将缓冲液B(缓冲液A+0.5 mol/L氯化钾)逐渐增加至5%，在随后35 min内达到35%，并在最后10 min内达到100%。使用COMIX吸头(Agilent Technologies)收集了27个馏分，并根据214 nm/280 nm吸收色谱图将其合并为8个馏分。在LTQ-Orbitrap XL质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)与Eksigent-Nano-HPLC系统(美国Eksigent Technologies公司)分析了N末端肽阴性富集后获得的样品。

1.5 MS数据分析

质谱数据利用Mascot(V2.3.2)进行检索。检索结果用Scaffold 4.3.2软件分析，利用Decoy数据库搜索策略。应用Gene Ontology数据库(http://www.pantherdb.org/)，初步分析差异蛋白所属细胞成分，参与的生物学过程及相应的分子功能。应用IPA数据库搜索差异蛋白相关信息，重要差异蛋白所属信号通路。具有重要意义的信号通路通过检索Pubmed相关文献进行验证及进一步分析。

1.6 统计学处理

将每种肽或蛋白质的通道归一化为所有通道的中值，从而提供了针对异常值的可靠策略，并允许在使用不同通道数的实验之间进行比较。对于人类样品，将iTRAQ报告基因强度进一步标准化为参考通道的强度。筛选N末端列表以获取内部neo-N-末端(位置≥3)。使用Multi Experiment Viewer v4.8(单向ANOVA)测定猪样品中差异丰富的蛋白质、neo-N-末端和比率。使用R语言中的heatmap2生成归一化途径富集

P

值的热图。矩阵相关性在R中执行，并使用corrplot可视化。使用Prism 5.0创建丰度分布图。

2 结果

2.1 猪烧伤创面渗出液iTRAQ-TAILS分析

图1显示了烧伤后0、2、4、6和8 d创面部位愈合情况，观察到创面随时间推移逐渐愈合。为了评估烧伤创面愈合的关键转折点(图1)，我们使用泡沫收集烧伤后多个时间段的创面渗出液，并在4plex iTRAQ-TAILS实验中测定它们的蛋白质组和neo-N-末端组。研究从猪创面渗出液中收集了1 060种可定量蛋白质和1 667种neo-N-末端的数据集(图2)，这些数据总共对应1 206个高可信度蛋白质鉴定。

图1 烧伤后0、2、4、6和8 d创面部位愈合情况

图2 猪烧伤创面渗出液的iTRAQ-TAILS数据集

每个样品和重叠样品中鉴定出的蛋白质和新N末端的数量；A定义了每个相交集的条目数；S定义最大的单个集合；U定义数据集的整体大小(Σ)

2.2 定量评估猪烧伤创面的模型建立

研究利用了基于iTRAQ的烧伤后多个时间点创面渗出液中蛋白质和neo-N-末端的相对定量建立了猪烧伤创面进展的定量评估模型。通过单向方差分析，确定了416种蛋白质和371种neo-N-末端的丰度随时间发生显著变化以及188个neo-N-末端子集[它们相对于整个蛋白质的丰度发生了显著变化(裂解)]。随后，研究使用模糊c均值聚类将差异丰富的蛋白质、neo-N-末端和裂解分配给时间分辨丰度分布的聚类(图3A)。差异丰富的蛋白质和neo-N-末端聚集非常相似，D2(聚类1)、D4(聚类2)、D4和D6(聚类3)具有很高的丰度；随着时间的推移，丰度持续增加(聚类4)； 第8天的丰度显著增加(聚类5)。IPA富集分析显示，与炎症相关的通路(巨噬细胞中的活性氧/一氧化氮合酶、急性期信号传导、补体系统)和损伤有关的通路(凝血系统)在烧伤后第4、6天(聚类2和3)具有高丰度以及与细胞增殖和迁移相关的蛋白质在监测的愈合阶段(第8天)(聚类4和5)具有高丰度(图3B)。

图3 时间分辨丰度聚类和IPA分析A:使用模糊c均值聚类将差异丰富的蛋白质、neo-N-末端和裂解分配给时间分辨丰度分布的聚类;B:IPA富集分析猪创面模型中聚集蛋白、neo-N-末端和裂解

2.3 黏着连接成分作为烧伤创面愈合的关键转折点标志物

为了进一步明确烧伤创面愈合的关键转折点标志物，研究采用归一化富集

P

值的相关矩阵对猪烧伤创面模型和患者数据得出的时间分辨蛋白丰度谱的相关性进行分析(图4A)。结果显示，上皮黏着连接动态相关的蛋白质丰度变化具有极高的相关性(0.84～0.98)。研究采用iTRAQ-TAILS评价猪创面渗出液中上皮黏着连接蛋白的丰度分布，发现包括黏附蛋白Zyxin(focal adhesion protein zyxin，ZYX)、Ras GTPase激活蛋白IQGAP1(Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1，IQGA1)、丝氨酸蛋白酶丝氨酸肽酶1(high temperature factor A-1，HTRA1)以及多种微管蛋白和肌动蛋白亚型(为上皮黏着连接蛋白相关的蛋白质网络的一部分)均在猪模型烧伤后收集的创面渗出液的丰度都增加了。采用iTRAQ-TAILS评价不同愈合动力学(快速愈合：在烧伤后第5天和第8天停止创面负压吸引治疗；缓慢愈合：在烧伤后第17天甚至第25天停止创面负压吸引治疗)人创面渗出液中选定候选蛋白ZYX、IQGA1以及HtrA1的丰度分布。与第一个采样时间点相比，在治疗结束时收集的渗出液中，所有三种蛋白质的含量都大大增加。结果表明，这些蛋白质潜在地适合作为创面负压吸引治疗患者创面渗出液中愈合进程的标志，但仍需转移到具有更大患者队列的扩展研究中进行验证。

图4 烧伤创面愈合的关键转折点标志物确认A:猪和人类数据集之间蛋白质水平的富集途径的相关性;B:iTRAQ-TAILS分析猪创面渗出液中上皮黏着连接蛋白的丰度分布;C～F:iTRAQ-TAILS分析快速和缓慢愈合动力学患者中选定候选蛋白ZYX、IQGA1以及HtrA1的丰度分布

3 讨论

在这项研究中，我们采用一种基于时间分辨质谱的降解分析方法对烧伤后多个时间点创面渗出液N-末端进行整体分析，并对复杂的组织反应进行降解分析。研究利用临床相关的猪烧伤创面愈合模型和高度敏感的多重iTRAQ-TAILS方法，从创面渗出液中鉴定出大约3 000种蛋白质，极大扩展了我们对创面渗出液蛋白质组含量的了解。我们的数据可用于在创面愈合过程中鉴定关键蛋白，临床前研究的设计以及用于解释临床数据的框架。在该模型中，我们观察到蛋白质丰度主要在D4和D6处增加(聚类3)，但在D8处蛋白质差异水解(聚类4)，提示蛋白水解事件可能对创面愈合的进展很重要。将此方法扩展到与蛋白水解活性异常相关的其他疾病(例如癌症、关节炎和炎症性疾病)有可能识别疾病进展过程中蛋白水解活性的关键波动。

当前生物医学研究的一个主要问题是无法将结果从基础研究模型转移到临床。对来自人类临床模型的样本进行直接分析通常会表现出较高的异质性，而简单的动物模型可能会提供高度可重复的均质结果，但通常无法充分代表人类的状况。本研究通过使用非常类似于临床治疗方案的猪烧伤创面模型克服了这个问题，因此，可以识别具有高度有效性的事件来解释临床数据集。两种模型之间的高度相似性，通过利用同质猪数据集作为人类数据建模的模板，使我们能够从人类数据中提取事件，这些事件在受伤后的各个时间点之间具有不同的丰度，进一步增强了我们完善的猪数据集的价值，将其作为应用创面负压吸引治疗方案的患者创面渗出液的蛋白质组学和降解组学分析的可靠标准。

创面缓慢愈合与炎症和组织降解失衡密切相关。因此，本研究旨在确定创面进展的指示性生物标志物，特别是在创面渗出液中炎症介质和组织降解蛋白酶变化。这些改变是继发于肉芽组织形成的延迟或缺乏和再上皮化的开始，反映了治疗进展中最关键的转折点。在本研究中，猪模型与患者数据之间相关性最高的标记物与表皮细胞(ZYX、IQGA1)和真皮成纤维细胞(HtrA1)的迁移和增殖直接相关，因此是这些过程的主要指标。其中，HtrA1是经典分泌的蛋白质，ZYX和IQGA1均主要与细胞骨架结构相关。在功能上，ZYX与局灶性黏连与细胞核间的信号转导有关，被认为是成熟局灶性黏连最显著的标志物。ZYX在创面愈合过程中发挥重要作用，先前研究发现，MDCK细胞中ZYX的敲除导致刮痕闭合延迟。另一项研究表明，与其他重要的黏着连接成分(例如，踝蛋白和桩蛋白)相反，ZYX有助于控制细胞的运动路径。我们的分析证实了ZYX在增生性伤口上皮中的功能性作用，因此有必要进一步剖析其潜在机制。肉芽组织的形成是创面愈合的最重要事件之一。HtrA1可抑制转化生长因子-β信号传导，并切割细胞外基质蛋白质和蛋白多糖，例如形成Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型前胶原的C-前肽。此外，HtrA1被描述为一种可能的肿瘤抑制因子，通过半胱天冬酶依赖性或非依赖性凋亡和失巢诱导细胞死亡。因此，HtrA1可能在细胞外基质重塑、细胞增殖和创面愈合增殖期炎症反应的调节中发挥重要作用。

综上所述，本研究利用iTRAQ-TAILS分析系统对烧伤创面渗出液中的蛋白质组及其蛋白水解调节作用进行时间分辨降解分析。通过分析来自猪烧伤模型的创面渗出液，TAILS鉴定了体内许多已知和新颖的蛋白水解加工事件，反映了这种高度复杂的组织反应中蛋白酶活性的关键域。此外，研究还确定接受创面负压吸引治疗的烧伤患者创面进展的指示性生物标记物候选物，为判断烧伤患者创面愈合情况的提供新的临床检验方法。