三种香型白酒中氨基甲酸乙酯的研究及聚类分析

卓俊纳，吴卫宇，陈 静，苏占元，赵金松，3

（1.四川轻化工大学，四川宜宾 644000；2.四川国检检测有限责任公司，四川泸州 646000；3.四川省酒业集团有限责任公司，四川泸州 646500）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，简称EC，分子式为H2NCOOC2H5）又称尿烷，是一种无色、无味的晶体或者白色粉末，普遍存在于发酵食品（面包、酱油[1]和酸奶等）和酒精饮料（威士忌[2]、黄酒[3]、葡萄酒[4]等）中。研究表明，EC 是一种多位点致癌物，可导致啮齿类动物患淋巴癌、肺癌、肝癌和皮肤癌等疾病[5]。乙醇对EC的致癌性有促进作用，而酒精饮类更是人类摄入EC的主要来源[6]。国际癌症研究署在1987年将其归为2B 类致癌物，并在2007年对其进行再次评估后改为2A 类致癌物[7-8]。加拿大卫生与防疫部门规定蒸馏酒中EC的限量为150 μg/L，目前我国尚未出台有关EC的限量标准[6，9]。

EC 的形成途径主要有两条，一是乙醇与氨基甲酸酯化合物（尿素，氨基甲酸酯磷酸和瓜氨酸）反应生成，二是在非酶条件下乙醇与氰化物之间反应生成[10-11]。pH 值、温度、光照水平、铜离子和精氨酸浓度等许多因素均会影响EC 的形成[12]。高温显著增加了EC的形成，尤其是在蒸馏和存储阶段[13]。

白酒是我国特有的传统酒种，是世界六大蒸馏酒之一，它拥有独特的酿造工艺和独特的酒体风味，因此深受消费者的喜爱。目前，国内关于EC的研究报道主要集中在黄酒、葡萄酒等酒精饮料中，对白酒中EC 的研究报道较少。在研究检测方法方面，陈路露等[14]应用GC-MS 方法检测白酒中EC 含量，并通过考察日内差和日间差，进一步证明该法有良好的精密度和准确度。薛锡佳等[15]采用液液萃取法，建立了白酒中氨基甲酸乙酯含量的快速检测方法。在含量分析方面，张顺荣等[16]采用衍生化和GC-MS/MS 联用技术研究了多种香型原酒和成品酒中EC 的含量，但是并未进行更清晰明了的数据对比。苏占元等[17]应用GC-MS 方法对浓香型、酱香型、清香型白酒和原酒中的EC含量进行检测，但并未进行直观的分类分析。

本研究以3 种香型白酒为研究对象，采用国标所制定的GC-MS 方法[18]检测分析了不同等级成品酒中EC 的含量，并采用SPSS 聚类分析法探讨白酒香型与等级和EC 含量的关系，期望为我国相关部门制定白酒中氨基甲酸乙酯风险控制标准提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

共有34 个酒样，包括浓香型成品酒12 个（均为52%vol，包含高端酒样4 个、中端酒样4 个、低端酒样4 个），酱香型成品酒12 个（均为53%vol，包含高端酒样4 个、中端酒样4 个、低端酒样4 个），清香型成品酒10 个（均为53 %vol，包含高端酒样4 个、中端酒样3个、低端酒样3个）。

1.1.2 试剂与仪器

试剂及耗材：碱性硅藻土固相萃取柱（10 mL），博纳艾杰尔；无水硫酸钠（Na2SO4），成都市科隆化学品有限公司；氯化钠（NaCl），重庆万盛川东化工有限公司；正己烷（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、乙醚（色谱纯），西陇化工股份有限公司；甲醇（色谱纯），OmniGene LLC；氨基甲酸乙酯标准品（Ethyl carbamate，C3H7O2N：纯度大于或等于99.0 %）；D5-氨基甲酸乙酯标准液（Ethan-d5-ol,carbamate，C3H2D5NO2：纯度大于或等于98.0%）。

仪器设备：气相色谱-质谱仪（6890N-5975B，Agilent Technologies）；氮吹仪（N-EVAP111，Organomation Associates,Jnc.）；分析天平（T200），江苏常熟双杰仪器公司；Milli-Q 超纯水仪，美国Milipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理

取2 g 酒样，加100 μL 的2.0 mg/L D5-氨基甲酸乙酯使用液，混合均匀，加样到10 mL 碱性硅藻土固相萃取柱上，让试样慢慢渗入到固相萃取柱中，静置约10 min。用10 mL 正己烷淋洗，弃去淋洗液。然后采用10 mL 的5%乙酸乙酯-乙醚洗脱液洗脱，洗脱液经装有2 g 无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水后，收集于10 mL 具塞刻度试管中，在40 ℃下氮吹仪吹至近干,用甲醇溶解并定容至1 mL 制成测定液，供GC-MS分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：DB-WAX（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies）；进样口温度：220 ℃，不分流进样，进样体积2 μL；色谱柱升温条件：初温50 ℃保持1 min，然后以8 ℃/min 升至180 ℃，10 ℃/min升至240 ℃保持10 min。载气为高纯氦气（99.999%），流速1.0 mL/min。

1.2.3 质谱条件

离子源：电子轰击源（EI），电子轰击能量70 eV；溶剂延迟时间11 min；四级杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；选择离子监测方式(SIM mode)，EC 监测离子为m/z 44、62、74、89。其中m/z 62 丰度大且干扰小，作为定量离子，其他离子用来定性。

1.2.4 标准溶液的配制

氨基甲酸乙酯储备液:准确称取0.01838 g 的氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇定容至100 mL，配制成浓度为0.1838 mg/mL的氨基甲酸乙酯储备液。

D5-氨基甲酸乙酯使用液：(1)准确吸取D5-氨基甲酸乙酯标准液（200 mg/L）1 mL，用甲醇定容至50 mL，配制成浓度为4 mg/L 的D5-氨基甲酸乙酯使用液；(2) 准确吸取D5-氨基甲酸乙酯标准液（200 mg/L）250 μL，用甲醇定容至25 mL，配制成浓度为2.0 mg/L的D5-氨基甲酸乙酯使用液。

氨基甲酸乙酯中间液：准确吸取氨基甲酸乙酯储备液（0.1838 mg/mL）500 μL，用甲醇定容至50 mL，配制成浓度为0.001838 mg/mL 的氨基甲酸乙酯中间液。

标准曲线工作溶液：准确吸取0.1838 mg/mL氨基甲酸乙酯中间液90 μL、225 μL、450 μL、900 μL、1800 μL、3600 μL、9000 μL，并分别加4 mg/L D5-氨基甲酸乙酯使用液500 μL，用甲醇定容至10 mL得到0.016542 mg/L、0.041355 mg/L、0.08271 mg/L、0.16542mg/L、0.33084mg/L、0.66168mg/L、1.6542mg/L的标准曲线工作溶液。

2 结果与分析

2.1 方法线性范围

由于所测酒样中的EC 含量差异较大，为了保证检测结果的准确性，实验确定了两个线性范围，并做出两条标准曲线。由表1 可以看出，在0.016542～0.33084 mg/L 与0.08271～1.6542 mg/L范围内，氨基甲酸乙酯的线性回归方程均具有良好的线性关系R2＞0.999。

表1 氨基甲酸乙酯的线性范围、线性方程及相关系数

2.2 3种香型成品酒中EC含量

实验收集了国内34 种白酒，按照香型和等级进行分类，其中浓香型12 种（低端酒样品编号NX1—4，中端酒样品编号NX5—8，高端酒样品编号NX9—12）、酱香型12 种（低端酒样品编号JX1—4，中端酒样品编号JX5—8，高端酒样品编号JX9—12）、清香型10 种（低端酒样品编号QX1—4，中端酒样品编号QX5—7，高端酒样品编号QX9—10），测定各白酒中的EC 含量，每个样品重复测定3 次，结果见表2。

表2 不同白酒样品分析结果 (μg/kg)

由表2可知，浓香、清香、酱香3种香型成品酒中EC检测率达到100%，且因为香型不同、等级不同，其含量分布也不同。高端浓香型白酒中EC平均含量最高(201.3 μg/kg)，高端酱香型次之(195.03 μg/kg)，其次是中端酱香型(122.24 μg/kg)，高端清香型(107.71 μg/kg)，中端浓香型(94.46 μg/kg)，低端酱香型(77.83 μg/kg)，中端清香型(39.14 μg/kg)，低端浓香型(21.6 μg/kg)，低端清香型白酒(17.11 μg/kg)EC平均含量最低。高粱是我国白酒酿酒的主要原料，其富含生氰糖苷［19］，不同酒厂使用的高粱品种不同也很可能导致最终白酒中EC 水平的差异，不同香型白酒由于其生产工艺的不同，也会导致最终EC含量的不同[20]。从表2 中也看出，同一香型不同等级白酒之间的EC 含量存在较大差异，且不同香型白酒均符合高端白酒中的EC 含量明显高于中低端白酒的规律，这是由于三大香型白酒的主要原料均为高粱，同一香型不同等级的白酒在生产过程中高粱的品种不同，高端白酒使用的高粱品种优于低端白酒，因而导致了3 种等级白酒中EC 含量的差异，这也和范文来等[21]报道的EC 主要在发酵过程中通过尿素途径和氰化物途径生成氨基甲酸乙酯相吻合。不同香型同一等级白酒之间的EC 含量存在较大差异，且酱香型与浓香型白酒的EC 含量远高于清香型白酒，这是由于不同香型白酒有不同的生产工艺。白酒中EC 的产生主要是酿酒发酵过程、蒸馏过程和存储过程[9]。酱香型白酒的主要原料之一是高粱，且其采用高温制曲，高温堆积，高温蒸馏，长期发酵，总共要经历九次蒸煮、八次发酵、七次取酒[22]，这些工艺会使EC 形成的前体物质增加。浓香型白酒的主要原料也是高粱，且一般都采用续米查法酿造，混蒸混糟、老窖续米查工艺[22]，因此高粱及浓香型白酒老窖的多次使用使老窖中微生物丰富，腐殖质含量增加，从而使EC 的前体物质增加[23]，使EC 含量增高。而酱香型白酒与浓香型白酒EC 含量的差异，可能是由于酱香型白酒的窖池结构和浓香型白酒的窖池结构有一定区别，浓香型白酒生产使用的是泥窖，而酱香型白酒使用的是泥底石窖，窖池除窖底外并未接触窖泥，因此氨基甲酸乙酯的前体物质要比浓香型白酒低一些[24]。清香型白酒的生产工艺与浓香型、酱香型白酒有较大区别，其采用的是地缸发酵，发酵温度较低[22]，导致微生物群落不太丰富，因而EC形成的前体物质较少，且低温也在一定程度上不利于EC 的形成[13]，所以清香型白酒的EC含量远低于酱香型与浓香型白酒。

2.3 聚类分析

聚类分析（cluster analysis，CA）是目前数据挖掘技术发展最好的分支之一，是将数据集的相似性样本归为若干类的方法[25]。采用SPSS22 对不同香型、不同等级的34 种白酒样品进行聚类分析，把性质相近的白酒归为一类。采用系统聚类分析，选择组间连接聚类，以欧氏距离平方为测量准则，聚类结果见图1、图2。

图1 浓香型(a)、酱香型(b)和清香型(c)白酒中EC含量聚类分析图

图2 低端(a)、中端(b)和高端(c)白酒中EC含量聚类分析图

2.3.1 同一香型不同等级白酒

从图1 中可以看出，当欧氏距离为7～25 时，12种浓香型白酒样品被分为两类，其中NX1、10、6、5、3、8、9、12 为第一类，NX7、11、4、2 为第二类。当欧氏距离为2～7 时，12 种酱香型白酒样品很好的被分为四类，其中JX10、12、1、4、3、9为第一类，JX2、8为第二类，JX5、11 为第三类，JX6、7 为第四类。欧氏距离为10～18 时，10 种清香型白酒样品被分为三类，其中QX1、10、7、6、3、8 为第一类，QX2、4、5为第二类，QX9 为第三类。可以看出，同一香型不同等级的白酒之间的聚类比较清晰，除个别特殊以外，基本按照等级进行归类。

2.3.2 不同香型同一等级白酒

从图2 中可以看出，当欧氏距离为8～12 时，12种低端白酒样品被分为三类，其中JX3、QX1、NX3、1、JX4、1、2、QX3 为第一类，QX2、4 为第二类，NX2、4 为第三类。当欧氏距离为7～16 时，11 种中端白酒样品被分为三类，其中NX6、QX6、NX5、8、QX7、JX8 为第一类，JX6、7 为第二类，NX7、QX5、JX5 为第三类。欧氏距离为7～25 时，11 种高端白酒样品被分为两类，其中JX10、12、NX10、9、JX9、QX10、NX12、QX8 为第一类，NX11、JX11、QX9 为第二类。可以看出，不同香型同一等级的白酒聚类比较杂乱，没有很好的将同一类别的样品进行归类。

3 结论

本研究主要应用GC-MS方法对不同等级的浓香型、酱香型、清香型成品酒中氨基甲酸乙酯含量进行分析。研究结果表明，香型不同、等级不同，EC 含量也不同。不同香型不同等级白酒中EC 的平均含量顺序为：高端浓香型＞高端酱香型＞中端酱香型＞高端清香型＞中端浓香型＞低端酱香型＞中端清香型＞低端浓香型＞低端清香型。采用SPSS22 对不同香型、不同等级的34 种白酒样品进行聚类分析，结果表明，当香型相同而等级不同时，酒样聚类比较清晰，除个别特殊以外，基本按照等级进行归类；当香型不同而等级相同时，酒样聚类比较杂乱，没有很好的将同一类别的样品进行归类。综上所述，白酒中氨基甲酸乙酯含量会因为香型不同或等级不同而有明显差异，因此制定白酒中氨基甲酸乙酯含量的控制标准具有复杂性与多变性，期望本研究能为我国相关部门制定白酒中氨基甲酸乙酯风险控制标准提供参考依据。