高效液相色谱法测定艾拉莫德起始原料中基因毒性杂质

朱小华,贺 琼,吴子旋

(1.常州佳德医药科技有限公司,常州 213164;2.常州工程职业技术学院 检验检测认证学院,常州 213164)

艾拉莫德为抗炎和抗风湿类药,由日本富山化学工业株式会社和卫材株式会社联合研发,海南先声药业有限公司在我国申报成功后于2011年上市,商品名为艾得辛,该药于2019年进入国家医保,现广泛应用于临床治疗类风湿性关节炎。2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮为艾拉莫德起始原料之一,该化合物合成过程中会用到中间体4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚,3种化合物的结构式见图1。

图1 3种化合物的结构式Fig.1 Structural formulae of 3 compounds

4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚结构中含有N-氧化芳香结构,为遗传毒性致癌性物质的警示结构[1],若在工艺中残留,可能会引入到艾拉莫德药品中,患者在服用后将会对人体DNA 产生直接或间接的损伤,引起基因突变或体内诱变,增加患癌的可能性[2-3]。起始原料的质量控制在原料药注册技术要求中起着重要的作用,各药审监督机构纷纷出台了相关的技术要求文件[4-10]。因此,应对2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的残留量进行测定,并规定合适的限度。根据欧洲药品管理局(EMA)«遗传毒性杂质限度指导原则»规定的限度,人体遗传毒性杂质的摄入量不能超过1.5μg·d－1,艾拉莫德片临床服药剂量为50 mg·d－1,计算得到艾拉莫德原料药中基因毒性杂质不得过30μg·g－1[11-12]。故拟定4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的合量限量为30μg·g－1。目前,除了公布了熔点和核磁的数据[13-16],国内对于4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的检测研究报道的较少。虽然色谱-质谱联用法灵敏度高,更适用于检测限量要求低的基因毒性杂质,但是4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚结构中均有硝基,在质谱中响应较低,故本工作建立了高效液相色谱法(HPLC)测定2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的残留量的方法,以期为这2种基因毒性杂质含量的监控提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配光电二极管阵列检测器。

4-氯-3-硝基苯甲醚对照品储备溶液:称取适量4-氯-3-硝基苯甲醚对照品,用乙腈溶解并稀释配制成3 g·L－1对照品储备溶液。

3-硝基-4-苯氧基苯甲醚对照品储备溶液:称取适量3-硝基-4-苯氧基苯甲醚对照品,用乙腈溶解并稀释配制成3 g·L－1对照品储备溶液。

混合对照品储备溶液:取适量4-氯-3-硝基苯甲醚对照品储备溶液和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚对照品储备溶液,用35%(体积分数,下同)乙腈溶液稀释配制成21,30,39 mg·L－1的混合对照品储备溶液A、B、C。

对照品溶液:取适量混合对照品储备溶液B,用35%乙腈溶液稀释配制成0.3 mg·L－1的对照品溶液。

4-氯-3-硝基苯甲醚对照品的纯度为99.9%;3-硝基-4-苯氧基苯甲醚对照品的纯度为97.8%;乙腈为色谱纯;磷酸、氨水为分析纯;试验用水为娃哈哈纯净水。

2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮供试品由常州佳德医药科技有限公司提供,批号分别为20190501、20190601、20190701。

1.2 仪器工作条件

Wondasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);柱温为35℃;流动相A为乙腈,B为0.01mol·L－1磷酸盐缓冲液(pH9.0,由磷酸和氨水混合而成);流量为1.0mL·min－1;进样量20μL;检测波长222 nm。梯度洗脱程序:0～5 min时,A 为40%;5～45 min时,A 由40%升至70%,保持5 min。

1.3 试验方法

取供试品约100 mg,用35%乙腈溶液9 mL于50 ℃水浴中超声溶解,加入0.2%(体积分数,下同)磷酸溶液1 mL,摇匀后静置,冷却至室温,在冰水浴析晶约30 min。取上清液1～2 mL,用0.45μm 滤膜过滤,滤液(供试品溶液)供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

由于供试品中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮含量较高,会导致色谱柱和检测器超载,进而影响目标物的测定,故试验依次采用合适的溶剂溶解样品、冰水浴析晶、滤膜过滤等方式来降低其含量。

溶剂的选择很关键,不仅要求其能溶解供试品,还能够保证2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮在冰水浴中充分析晶,经过反复试验,选择的溶剂为35%乙腈溶液。

2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮为中性化合物,其在酸性环境中容易结晶,故试验比较了分别加入1 mL 水、0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.3%磷酸溶液,冰水浴析晶后滤液中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮的含量。结果显示:当加入0.2%磷酸溶液和0.3%磷酸溶液后,滤液中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮的含量较低。综合考虑,试验选择加入0.2%磷酸溶液1 mL。

2.2 检测波长的选择

按照仪器工作条件分析混合对照品储备溶液B,在波长190～500 nm 内进行紫外-可见扫描,所得光谱图见图2。

由图2可知:2种目标物均在波长222 nm 处有较大吸收,故试验选择的检测波长为222 nm。

图2 4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的紫外-可见光谱图Fig.2 UV-Vis spectra of 4-chloro-3-nitroanisole and 3-nitro-4-phenoxyanisole

2.3 色谱柱的选择

试验分别考察了InertSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Kramosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等3种色谱柱对2种目标物的分离效果的影响。结果显示:用Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)进行分离时,酸度适用范围较宽(pH 1～10),供试品溶液中其他杂质对2 种目标物的测定干扰较小,可满足要求。

2.4 专属性试验

按照仪器工作条件测定对照品溶液、供试品溶液和35%乙腈溶液,色谱图见图3。

图3 对照品溶液、供试品溶液和35%乙腈溶液的色谱图Fig.3 Chromatograms of reference solution,test solution and 35%acetonitrile solution

由图3可知:供试品中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮可与4-氯-3-硝基苯甲醚、3-硝基-4-苯氧基苯甲醚完全分离,保留时间分别为10.051,24.004,33.300 min;溶剂35%乙腈溶液及样品中其他杂质对2种目标物的测定无干扰,说明本方法的专属性良好。

2.5 稳定性试验

将新鲜制备的对照品溶液分别放置0,1,2,4,8,12,16,24 h后注入色谱仪,按照仪器工作条件测定。结果显示:4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚测定值的相对标准偏差(RSD)分别为1.3%,1.2%,说明这2种目标物在24 h内稳定性良好。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

用35%乙腈溶液将4-氯-3-硝基苯甲醚对照品储备溶液和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚对照品储备溶液逐级稀释配制成的0.03,0.10,0.20,0.30,0.45,0.60 mg·L－1混合对照品溶液系列,以2种目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:这2种目标物的线性范围均为0.03～0.60 mg·L－1,线性回归方程分别为y＝92.95x－0.520 8和y＝93.30x＋0.745 2,相关系数均为0.999 7。

分别以3倍、10倍信噪比(S/N)计算4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),所得检出限分别为9.97,10.04μg·L－1,测定下限分别为33.20,33.47μg·L－1。

2.7 精密度试验

2.7.1 重复性

按照试验方法配制6份加标供试品溶液(2种目标物的加标量为0.30μg),平行分析6次,4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚测定值的RSD 分别为3.2%,4.5%。

2.7.2 中间精密度

参照«中华人民共和国药典»(2020年版)于重复性试验的第2 天由另一位检验员在岛津LC-20AD 型液相色谱仪按2.7.1节方法进行试验,计算2 d所得的12组数据的RSD,4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的RSD 分别为4.4%,6.2%,表明该方法具有良好的中间精密度。

2.8 回收试验

按照试验方法对供试品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,结果见表1。

表1 回收试验结果Tab.1 Results of test for recovery

由表1可知:4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的回收率分别为94.5%～104%和89.0%～104%。

2.9 耐用性试验

适当调整色谱条件参数[缓冲液pH (9.0±0.1)、流量(1.0±0.1)m L·min－1、同型号不同批号色谱柱],按照仪器工作条件分析供试品溶液和对照品溶液。结果显示,当色谱条件参数发生较小变动时,对4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的测定无明显影响,说明本法具有良好的耐用性。

2.10 样品分析

按照试验方法分析3批供试品,均未检出3-硝基-4-苯氧基苯甲醚,检出的4-氯-3-硝基苯甲醚的质量分数分别为4.46,3.94,4.12μg·g－1。

本工作建立了高效液相色谱法测定2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中基因毒性杂质4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚含量的方法,该方法具有成本低廉、灵敏度高、操作简单、准确度高等优点,可广泛应用于艾拉莫德生产行业。