化学发光分析与高效液相色谱联用测定芦丁片剂中芦丁含量

吴 华,闵媛婷,刘立明,石小涛,郑 轩,胡飞跃,夏志刚,雷克亮,胡双修∗

(1.三峡大学 第二人民医院,宜昌 443000;2.三峡大学 生物与制药学院,宜昌 443002;3.三峡大学 水利与环境学院,宜昌 443002;4.湖北省黄冈市生态环境局麻城市分局,麻城 438300)

芦丁又称芸香苷,化学名为5,7,3,4-四羟基-3-芸香糖黄酮,广泛存在于中草药中,其在豆科植物槐米、芸香科植物芸香草、蓼科植物荞麦、鼠李科植物光枝勾儿茶及大蓟科植物野梧桐中的含量特别高。

芦丁的显著特点是具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力,因而具有抗衰老、抗基因突变、抗癌等功效。芦丁还具有镇咳、利尿、镇痛、抗炎、抗病毒和增强免疫力等功能,对预防和治疗心脑血管疾病、痛风和糖尿病等均有显著疗效[1-3]。因此,芦丁在临床上用途十分广泛,具有巨大的药用价值。

芦丁含量的测定对其药剂质量控制具有十分重要的意义。检测芦丁的常用方法有电极法[4]、荧光分光光度法[5]、高效液相色谱法等[6]。电极法检测仪器便宜,但选择性差、灵敏度低;荧光光谱法和高效液相色谱法的选择性较好、灵敏度较高。流动注射化学发光分析检测芦丁的方法有铁氰化钾直接氧化芦丁化学发光法[7]、芦丁增强鲁米诺-高锰酸钾化学发光法[8]。化学发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、易操作、分析快速等优点,但选择性较差[9-12]。本工作将化学发光分析与高效液相色谱联用来检测芦丁,较好地弥补了化学发光分析选择性差的缺点。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-6A 型高效液相色谱仪;BPCL 型微弱发光测量仪;HL-2型恒流泵;RF-540 型荧光仪;751 型分光光度计;HY-B1型超声波振荡器。

鲁米诺标准储备溶液:称取0.886 0 g鲁米诺于500 mL烧杯中,加入1 mol·L－1的氢氧化钠溶液20 mL,用水溶解并转移至500 mL容量瓶中,定容,摇匀,配制成浓度为1.0×10－2mol·L－1的鲁米诺标准储备溶液,于4 ℃保存,储存15 d以上再用于试验(储存15 d以上,其化学发光效果好,灵敏度高,而新配制的鲁米诺溶液,化学发光效果差,灵敏度低)。

芦丁标准储备溶液:称取0.040 0 g 芦丁于100 mL烧杯中,用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成质量浓度为0.40 g·L－1的芦丁标准储备溶液,于4 ℃保存。

高锰酸钾标准储备溶液:称取1.580 3 g高锰酸钾于100 mL烧杯中,用水溶解并转移至100 mL棕色容量瓶中,定容,摇匀,配制成浓度为1.0×10－1mol·L－1的高锰酸钾标准储备溶液,于4 ℃保存。

芦丁片剂1～3,规格25 mg/片,每片0.5 g(换算标示量50.00 mg·g－1);所用试剂均为分析纯;试验用水为去离子二次蒸馏无酚水(在蒸馏器里加少量高锰酸钾,使酚类物质被高锰酸钾氧化后挥发,弃去开始0.5 h内接收的蒸馏水,随后接收的蒸馏水将不含酚类)。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温40 ℃;流量1.0 mL·min－1;流动相为体积比6∶4的甲醇-2%(体积分数,下同)冰乙酸溶液的混合液(即体积比60∶40∶1的甲醇-水-冰乙酸混合液);进样体积20μL。

2)化学发光条件 氢氧化钠-鲁米诺混合溶液(其中氢氧化钠浓度为2.0×10－2mol·L－1,鲁米诺浓度为2.0×10－5mol·L－1);1.5×10－4mol·L－1的高锰酸钾溶液;流量4 cm·s－1;检测盘管长度为10 cm。

1.3 试验方法

1.3.1 化学发光分析与高效液相色谱的联用原理

改装BPCL 型微弱发光测量仪,将流通池盘管正对检测窗,流动注射进样。按图1连接高效液相色谱仪和化学发光分析检测系统。

图1 化学发光分析与高效液相色谱联用流程图Fig.1 Flow diagram of high performance liquid chromatography coupled with chemiluminescence detection

将氢氧化钠溶液和鲁米诺溶液先经三通与高效液相色谱仪出口端混合,流经混合管(MC,5 cm),再经三通与1.5×10－4mol·L－1高锰酸钾溶液混合,进入流通池盘管(10 cm)。在强碱性条件下,高锰酸钾氧化鲁米诺发生化学发光反应,经高效液相色谱仪洗脱分离的芦丁对该化学发光反应产生增敏作用。BPCL型微弱发光测量仪将检测到的流通池盘管中的化学发光强度信号转化为数字信号,并输入联用的计算机中,计算机每0.1 s自动采集一个数据,以峰高定量。根据芦丁的质量浓度与化学发光强度信号的峰高建立线性回归方程。

流动相、芦丁标准溶液、芦丁样品溶液需经0.45μm 滤膜过滤、超声波振荡器振荡去气泡,静置30 min后使用。

1.3.2 样品的测定

将市售芦丁片剂在干燥器中干燥8 h后,于研钵中研磨成粉末,称取1.00 g芦丁粉末于索氏提取器中,加入100 mL甲醇后,回流加热5 h,提取液经0.45μm 滤膜抽滤,超声波振荡器振荡去气泡,静置30 min,制得待测样品溶液。用20μL进样器进样,按上述仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

在流量为1.0 mL·min－1、流动相为体积比6∶4的甲醇-2%冰乙酸溶液的混合液的条件下,芦丁标准溶液和芦丁样品溶液的色谱图见图2。

由图2可知,芦丁的保留时间为6.20 min,在上述色谱条件下,芦丁具有较好的分离效果。

图2 芦丁标准溶液和芦丁样品溶液的色谱图Fig.2 Chromatograms of rutin standard solution and rutin sample solution

2.2 化学发光反应条件的选择

2.2.1 氢氧化钠-鲁米诺混合溶液中氢氧化钠的浓度

由于高锰酸钾氧化鲁米诺产生化学发光反应需要在pH 大于12的强碱性介质中进行,而甲醇-冰乙酸流动相体系为酸性,因此可通过增大氢氧化钠-鲁米诺混合溶液中氢氧化钠的浓度,使流通池盘管中混合液pH 大于12。

试验缓慢增大氢氧化钠-鲁米诺混合溶液中氢氧化钠的浓度,并同步检测流通池盘管中混合液的酸度。结果表明,当氢氧化钠-鲁米诺混合溶液中氢氧化钠的浓度增大至2.0×10－2mol·L－1时,流通池盘管中混合液的pH 刚好达到12,因此试验选择氢氧化钠-鲁米诺混合溶液中氢氧化钠的浓度为2.0×10－2mol·L－1。

2.2.2 鲁米诺的浓度

试验考察了鲁米诺的浓度对化学发光强度的影响,结果见图3。

图3 鲁米诺浓度对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of concentration of luminol on intensity of chemiluminescence

由图3可知:当鲁米诺的浓度较低时,化学发光强度随鲁米诺浓度的增大而增大;当鲁米诺的浓度超过2.0×10－5mol·L－1时,化学发光强度随鲁米诺浓度的增大而降低,这可能是因为鲁米诺对化学发光反应产生的光子有吸收作用[12],从而导致化学发光强度降低。因此,试验选择鲁米诺浓度为2.0×10－5mol·L－1。

2.2.3 高锰酸钾的浓度

试验考察了高锰酸钾的浓度对化学发光强度的影响,结果见图4。

图4 高锰酸钾浓度对化学发光强度的影响Fig.4 Effect of KMn O4 concentration on intensity of chemiluminescence

由图4可知:当高锰酸钾的浓度较低时,化学发光强度随高锰酸钾浓度的增加而增大;当高锰酸钾的浓度超过1.5×10－4mol·L－1时,化学发光强度随着高锰酸钾浓度的增大而降低,这可能是因为高锰酸钾的分解产物二氧化锰沉淀物对化学发光反应产生的光子有散射作用,导致化学发光强度降低。因此,试验选择高锰酸钾的浓度为1.5×10－4mol·L－1。

2.2.4 检测盘管与三通阀之间的距离以及长度的选择

静态化学发光动力曲线结果表明,化学发光强度瞬时能达到较大值,0.5 s达到最大值,3 s后降至空白值。发光试剂与流动相混合处和检测盘管(检测盘管是流通池盘管的一部分)之间的接头距离约2 cm,流量为4 cm·s－1,则此段耗时0.5 s,而该化学发光反应是快速反应,0.5 s时化学发光强度达最大。因此,为了尽可能检测到强发光时段的化学发光信号,这就要求检测盘管与三通阀之间的距离尽可能短,试验将盘管固定在三通阀下底。

增加检测盘管的长度有利于检测到更多的光子信号,提高灵敏度及检出限,但检测盘管不宜过长,否则色谱峰展宽,使得峰高降低。化学发光持续时间为3 s,流量为4 cm·s－1,故盘管不宜超过12 cm。在相同条件下,分别选择盘管长度为6,7,8,9,10,11,12 cm 进行试验。结果表明,盘管长度10 cm 时测得的化学发光强度较大,因此试验选择检测盘管长度为10 cm。

2.3 标准曲线和检出限

在上述色谱条件和优化的化学发光条件下,对质量浓度分别为1.00,10.00,50.00,100.00,150.00μg·L－1的芦丁标准溶液系列进行测定。以芦丁的质量浓度为横坐标,对应的化学发光强度为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,芦丁的质量浓度在1.00～150.00μg·L－1内与化学发光强度呈线性关系,线性回归方程为y＝18.70x＋16.30,相关系数为0.999 2。

以线性范围的下限作为检出限,则该方法的检出限为1.00×10－6g·L－1。将本方法所得的检出限与文献中的方法进行比对,结果见表1。

表1 不同方法比对结果Tab.1 Comparison of results by different methods

由表1可知,本方法具有较低的检出限。

2.4 精密度和回收试验

按照试验方法测定50.00μg·L－1的芦丁标准溶液,平行测定11次,并计算测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明,测定值的RSD 为2.7%,说明方法具有较好的精密度。

按试验方法对市售芦丁片剂1～3(标示量50.00 mg·g－1)进行测定,测定值分别为48.60,47.40,48.00 mg·g－1,说明测定值与标示量吻合。对上述样品进行加标回收试验,每个样品平行测定5次,计算回收率,结果见表2。

表2 回收试验结果(n＝5)Tab.2 Results of test for recovery(n＝5)

本工作建立了化学发光分析与高效液相色谱联用检测芦丁的方法,该方法操作简单、快速、灵敏度高,能准确地测定实际样品中芦丁的含量。