低温硝基苯降解菌的降解动力学研究

孙大鹏

(辽宁省环境监控中心，辽宁沈阳 110161)



低温硝基苯降解菌的降解动力学研究

孙大鹏

(辽宁省环境监控中心，辽宁沈阳 110161)

[目的]研究一株低温硝基苯降解菌的降解动力学。[方法]对一株耐低温硝基苯降解菌进行研究，考察了其最适生长条件及在不同硝基苯初始浓度下的生长和降解情况，并进行降解动力学研究。[结果]当温度为15 ℃，pH为7，摇床转速为140 r/min，接种量为10%时，最适宜该菌株生长。该菌株培养48 h对200 mg/L硝基苯的好氧降解率达60.53%。当硝基苯初始浓度>100 mg/L时，该菌株的降解动力学符合Andrews抑制方程-非竞争性底物抑制模型。[结论]该研究可为硝基苯实际废水生化处理提供理论依据。

硝基苯；鲍曼不动杆菌；生物降解；动力学

硝基苯是一种带有苦杏仁味的、淡黄色油状液体，且不仅微溶于水，还易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。硝基苯是一种重要的化工合成原料，大量用于合成苯胺、炸药、染料、塑料等，且在某些工业领域中，如医药和农药等都具有重要的用途。尤为重要的是，硝基苯可以废气废水为载体，或者以储存运输、生产过程中的意外事故为途径大量进入环境。硝基苯进入水体会长时间保持不变[1-2]，对水体的污染持续时间相当长，并且硝基苯是高毒物质，具有“三致”效应，严重危害人体健康[3-4]，已被列入世界《环境优先控制有毒有机污染物》的名单前列[5-6]。

由于生物方法日趋成熟且成本较低，近年来较多使用[7-9]。该试验将低温保存的一株硝基苯降解菌进行驯化培养[10]，并对其影响硝基苯降解率的环境因素及不同初始浓度下的硝基苯降解进行研究，分析了降解动力学特征[11-12]，为硝基苯实际废水生化处理提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源以东北制药总厂曝气池和集水池污泥为菌源，分离、筛选得到了一株在低温条件下能以硝基苯为唯一碳源生长的菌株，经鉴定为鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)[10，13-14]。

1.2 培养基与试剂平板培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g、蒸馏水1 L、pH 7.0。无机盐培养基：Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、NH4Cl 0.1 g/L、MgSO40.2 g/L、蒸馏水1 L、pH 7.0。培养基中均添加一定量的硝基苯，121 ℃灭菌30 min。

1.3 试验仪器恒温振荡培养箱(HZQ-QX，哈尔滨东联电子技术有限公司)；灭菌箱(MLS-3750，日本三洋电机公司)；生化培养箱(LRH-250A，广东省医疗器械研究所)；电子天平(BS110S，德国赛多利斯)；紫外分光光度计(Cary 50，美国Varian)；离心机(ANKE TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；冰箱(BCD-247，德国西门子)。

1.4 试验方法

1.4.1菌株的驯化。 将低温保存的鲍曼不动杆菌转移到平板培养基上15 ℃进行培养，硝基苯浓度为30 mg/L，首次培养可能需要较长时间，大概3～4 d可以看到明显菌落。然后将此菌落在同浓度硝基苯的条件下再次转移，培养48 h后接种到50 mg/L硝基苯的平板上，之后逐渐增大硝基苯浓度。 无菌条件下将最后一次平板培养基的菌种置于硝基苯为50 mg/L的无机盐培养基中，在培养箱中恒温振荡培养，每48 h进行转移，并逐步提高硝基苯浓度。

1.4.2菌株最适生长条件的确定。

1.4.2.1最适温度。配制无机盐培养基100 ml于250 ml的锥形瓶中，硝基苯的浓度为200 mg/L(接入菌液后的体积和浓度)，以10%(体积分数)接菌量接入对数生长期菌液，分别在10、15、20、25、30、35 ℃恒温摇床振荡培养，pH为7，摇床转速140 r/min，48 h后取样测定菌株的生长和硝基苯降解情况。

1.4.2.2最适pH。在250 ml锥形瓶中配制体积为100 ml的无机盐培养基，硝基苯浓度为200 mg/L(接入菌液后的体积和浓度)，以10%(体积分数)接菌量接入对数生长期菌液，15 ℃，摇床转速140 r/min，pH分别为4、5、6、7、8、9恒温振荡培养，48 h后取样测定菌株的生长和硝基苯降解情况。

1.4.2.3最适摇床转速。配制无机盐培养基100 ml于250 ml的锥形瓶中，硝基苯的浓度为200 mg/L(接入菌液后的体积和浓度)，以10%(体积分数)接菌量接入对数生长期菌液，15 ℃，pH为7，并以50、100、140、160和200 r/min的摇床转速为条件进行振荡培养，48 h后取样测定菌株的生长和硝基苯降解情况。

1.4.2.4最佳接菌量。配制无机盐培养基100 ml于250 ml的锥形瓶中，硝基苯的浓度为200 mg/L(接入菌液后的体积和浓度)，分别按1%、5%、10%、15%、20%(体积分数)的接种量接入对数生长期菌液，15 ℃，pH为7，摇床转速140 r/min恒温振荡培养，48 h后取样测定菌株的生长和硝基苯降解情况。

1.4.3硝基苯浓度对菌株的生长及降解的影响。分别配制100 ml无机盐培养基于250 ml已灭菌的锥形瓶中，使硝基苯浓度分别为50、100、150、200和400 mg/L，加入体积分数为10%的对数生长期菌液，在pH为7，温度为15 ℃，摇床转速是140 r/min的恒温培养箱中进行振荡降解，每12 h进行取样，绘制生长曲线并测定硝基苯浓度。

1.4.4降解动力学初步分析。将不同浓度的硝基苯加入以硝基苯为唯一碳源的无机盐培养基中，于最佳降解条件下每隔一定时间取样，测定在降解过程中硝基苯的浓度变化。根据试验数据，进而求出相应硝基苯比降解速率，同时对所求的数据及初始浓度进行拟合，最终求出模型参数。

1.5 分析方法细胞浓度以新鲜去离子水作参比，采用光电比浊法测定溶液OD600。硝基苯浓度则采用气相色谱法测定。对样品进行离心后，取其上清液并用正己烷对上清液进行萃取，过无水硫酸钠柱后进样。气相色谱条件：检测器类型为EDC检测器；进样口温度为210 ℃；柱温为100 ℃，其保持1 min，然后以12 ℃/min升温至210 ℃；检测器温度为300 ℃；进样量为1 μl。

2 结果与分析

2.1 菌株生长的最适条件

2.1.1温度对菌株生长的影响。由图1可见，菌株在10～35 ℃条件下均可生长且对硝基苯有不同程度的降解。在15 ℃时，菌体的生物量以及对硝基苯的降解率均达到最大，为最适温度，温度过高会破坏细胞机体，甚至导致细胞死亡，影响菌体对硝基苯的降解。因此，15～25 ℃为最适菌株生长的温度范围。

2.1.2pH对菌株生长的影响。由图2可知，菌株在中性到偏弱碱性条件下对硝基苯的降解能力较强。当pH在6～9之间时，菌株能够保持其较好的生长能力以及硝基苯降解能力，特别是在pH为7时达到最大值，为菌株最适pH。由此可知，该菌株属于中性微生物。

2.1.3摇床转速对菌株生长的影响。对于好氧菌，转速较高的情况下可以提高氧的转移速率，从而使得菌株的生长得到促进，硝基苯的降解率得以提高，而在较低转速的情况下，培养液中的溶氧量较少导致菌株生长量的下降。如图3所示，当转速<140 r/min时，菌株的生长及其降解能力都受抑制，而随着转速的增加，菌株的生长和降解能力有所提升。转速>140 r/min时，菌株硝基苯降解速度和生长量增幅比较小，说明140 r/min已可以满足菌株生长和降解的要求。因此，最适的摇床转速为140 r/min。

2.1.4接种量对菌株生长的影响。由图4可知，菌株的生物量随着接种量的增加而逐渐增大，菌株对硝基苯的降解能力也渐渐得到提高，但是当菌株接种量>10%的时候，菌株的生长情况和降解能力并没有随着接种量的增加而显著增长。这是因为接种量过大使菌株处于贫营养状态，生长代谢能力受到抑制，从而降低硝基苯的降解速率。因此，最适接种量为10%。

2.2 不同硝基苯初始浓度下菌株的生长及硝基苯降解情况

2.2.1不同硝基苯初始浓度下菌株的生长情况。图5为在以硝基苯为唯一碳源的无机盐培养基中，硝基苯的初始浓度分别为50、100、150、200、400 mg/L，在上述最适生长条件下菌株的生长情况。由于硝基苯的毒性较大，对菌体的生长有很大的抑制作用，即便是经过驯化的降解菌也需要一定的适应期，因此前12 h为菌株的生长停滞期。12～48 h为菌株的对数生长期，菌株代谢机能活跃，个数呈对数增长，此时大量硝基苯被降解。48～72 h为菌株生长的稳定期，此期间菌株的生长和死亡达到动态平衡，个数基本维持不变。进入衰亡期是在72 h后，硝基苯的不足导致大多数的细胞出现了自溶现象并死亡， 菌株个数开始减少。如图5所示，当硝基苯浓度为400 mg/L时，对菌体产生了非常明显的毒性，菌体活性基本被抑制，菌株不生长。因此，该试验菌体对硝基苯的耐受浓度为400 mg/L。

2.2.2不同初始浓度下菌株降解硝基苯的情况。从图6所展现的菌株对硝基苯的降解情况可知，当摇床转速为140 r/min，温度为15 ℃，pH为7时，当50 mg/L作为硝基苯初始浓度时，硝基苯可于72 h时被完全降解；初始浓度为100和200 mg/L时，菌株经48 h降解率分别达到了77.13%和60.53%。对数生长期是降解的主要发生期，主要是由于这个期间菌株具有较强的繁殖能力，随之增大的还有其对碳源的需求，降解过程迅速，这就导致了硝基苯浓度下降较快。而在此之后，培养基中的硝基苯已经减少又没有新的碳源来进行补充，代谢产物也接连不断地积累，菌体的数量基本上呈现不增加的状态，降解缓慢。

2.3 硝基苯的生物降解动力学如图7所示，当硝基苯初始浓度低于100 mg/L时，菌株对硝基苯的降解符合零级反应动力学，即c=-kt+b(c为硝基苯的浓度，k为降解速率，t为降解时间，b为常数)。反应速率与硝基苯浓度呈正比例关系，降解率随着硝基苯浓度的增加而增加，说明在100 mg/L范围内硝基苯的浓度越高，微生物利用营养物质也越充分，因此能够更好地进行生长和大量繁殖，从而提高了降解速率。

由于硝基苯对微生物具有毒性，当硝基苯的初始浓度增加至一定程度时，反应速率不再随着初始浓度的增加而升高，降解率下降，因为高浓度条件下对微生物产生了抑制现象。当硝基苯初始浓度>100 mg/L时，采用简单且常用的Andrews抑制方程-非竞争性底物抑制模型(式1)对菌株降解硝基苯进行动力学描述。

(1)

式中，μmax为硝基苯的最大比降解速率(h-1)，S为硝基苯浓度(mg/L)，KS和Ki分别为底物饱和常数和底物抑制常数(mg/L)。根据所取得的试验结果，通过非线性最小二乘法对数据进行拟合，得出的动力学模型参数分别为μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。对式(1)求导，得出S=(KSKi)1/2=59.22 mg/L，μ取最大值为0.72 h-1, 这一结果为硝基苯废水的生物处理工艺提供了重要的参考条件。

3 结论

(1)将在低温条件保存下的一株能以硝基苯为唯一碳源生长的鲍曼不动杆菌进行复壮，其最适生长条件为温度15 ℃，pH为7，摇床转速140 r/min，接种量10%。

(2)在以硝基苯为唯一碳源的无机盐培养基中，鲍曼不动杆菌12 h进入对数生长期，48 h趋于稳定生长，72 h后开始衰亡。当硝基苯初始浓度为50 mg/L，72 h可被完全降解，菌株48 h对浓度为200 mg/L硝基苯的降解率是60.53%，无法直接降解400 mg/L的硝基苯。

(3)当硝基苯初始浓度低于100 mg/L时，菌株对硝基苯的降解符合零级反应动力学，相关系数为0.981～0.995。硝基苯初始浓度>100 mg/L时，采用Andrews抑制方程-非竞争性底物抑制模型进行拟合，模型参数分别为μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。

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Study on Degradation Kinetics of Low-temperature Nitrobenzene Degrading Bacteria

SUN Da-peng

(Liaoning Province Environmental Monitoring Center, Shenyang, Liaoning 110161)

[Objective] The research aimed to study degradation kinetics of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria. [Method] The optimal growth condition of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria, and its growth and degradation situations under different initial concentrations of nitrobenzene were inspected, and its degradation kinetics was studied. [Result] Under the condition of temperature 15 ℃, pH 7, rotation speed 140 r/min and inoculum amount 10%, it was optimal for the bacteria growth. After cultivated for 48 h, degradation rate of 200 mg/L nitrobenzene by the bacteria reached 60.53%. When initial nitrobenzene concentration was more than 100 mg/L, degradation kinetics of the bacteria corresponded to Andrews inhibition equation-non-competitive substrate inhibition model. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for biological treatment of actual nitrobenzene wastewater.

Nitrobenzene;Acinetobacterbaumannii; Biological degradation; Kinetics

孙大鹏(1977-)，男，辽宁沈阳人，硕士，从事环境污染源监控管理研究。

2015-02-09

S 181.3;X 172

A

0517-6611(2015)09-243-03