PNTU 探针-荧光猝灭法测定Hg2＋的含量

刘 丹,陈安银,2,向文军,颜 爽,杨 雄

(1.四川文理学院 化学化工学院,达州 635000;2.四川文理学院“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室,达州 635000)

Hg2＋是具有生理毒性的过渡金属离子之一[1-2],其毒性具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性,会对人体造成极大的危害[3-4],因此开发和研究新型的Hg2＋识别方法显得尤为重要。如何快速、高选择性、灵敏地检测Hg2＋,成为众多科研工作者努力的方向。目前,识别Hg2＋的方法有很多,如原子发射光谱法[5]、原子吸收光谱法[6]、极谱法[7]、电化学传感器[8]、光化学传感器[9-10]等,但这些方法存在成本高、合成工艺复杂、灵敏度低等问题。荧光猝灭法操作简单,无需贵重仪器,被广泛应用于建立离子识别体系中[11]。

本工作制备了一种易于合成的硫脲分子PNTU探针(后文1.3.1节,结构式见图1),基于其对Hg2＋的专一性、高灵敏度比色识别特性,建立了荧光猝灭法测定Hg2＋含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500型荧光分光光度计;Mercury-400BB 型核磁共振仪。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPS)缓冲液:10 mmol·L－1,pH 7.4。

PNTU探针溶液:称取10.40mg制备好的PNTU探针,用乙腈溶解并定容至5 mL容量瓶中,配制成浓度为5 mmol·L－1的PNTU 探针溶液。

Hg2＋标准储备溶液:称取4.50 mg Hg(ClO4)2·3H2O,用水溶解并定容至50 mL 容量瓶中,配制成浓度为20.0μmol·L－1的Hg2＋标准储备溶液。使用时用水逐级稀释至所需浓度。

所用试剂均为分析纯;试验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

光谱带宽为5 nm;光电倍增管电压为400 V;激发波长为447 nm,发射波长为525 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 PNTU 探针的合成与表征

称取4-溴-1,8-萘酐1.390 g(2.71 mmol)于15 mL乙醇中,逐滴加入2 mL 80%(质量分数)水合肼溶液,室温反应过夜后,抽滤,滤饼用乙醇、水洗涤后干燥。取第一步产物A 0.873 g(3 mmol),加入10 mL吡咯烷,氮气保护下加热回流过夜。充分反应后,将反应液冷却至室温,倒入冰水中,过滤,得到红褐色固体,用冰水洗涤后干燥。取第二步产物B 0.280 g(1 mmol)于15 mL乙腈中,室温搅拌下滴加1 mL 异硫氰酸苯酯(Ph NCS),加热回流过夜。反应完成后减压浓缩以除去溶剂,用水充分洗涤得到最终目标产物PNTU探针。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:10.00(s,1 H),9.88(s,1 H),8.80(d,J＝16.2 Hz,1H),8.48(d,J＝6.9 Hz,1 H),8.28(d,J＝8.6 Hz,1 H),7.66(t,J＝7.8 Hz,1 H),7.06～7.56(m,5H),6.94(d,J＝8.5 Hz,1 H),3.79(s,4H),2.02(s,4 H)。

PNTU 探针的合成反应路线见图1。

图1 PNTU 探针的合成Fig.1 Synthesis of PNTU probe

1.3.2 PNTU 探针对Hg2＋的识别原理

向PNTU 探针溶液中加入一定量的Hg2＋,按仪器工作条件测定加入Hg2＋溶液前后体系的荧光强度。结果发现,当加入Hg2＋后,体系荧光发生明显猝灭(图2),溶液颜色由黄色变为橙红色。据此,可建立PNTU 探针对Hg2＋的比色识别。

图2 荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectrum

1.3.3 样品的测定

将4μL的20μmmol·L－1的PNTU 探针溶液与2 mL体积比为8∶2的乙腈-HEPS缓冲液的混合液混合均匀,然后加入含Hg2＋的样品溶液,反应1 min,按仪器工作条件分别测定体系加入样品溶液前后的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

试验考察了分别以甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈等有机溶剂与HEPS 缓冲液混合后作为溶剂时对PNTU 探针识别Hg2＋的影响。结果显示,当以乙腈-HEPS缓冲液的混合液为溶剂时,体系的荧光强度降低值较大。

试验进一步考察了乙腈、不同体积比(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9)的乙腈-HEPS缓冲液的混合液、HEPS缓冲液对体系荧光强度的影响。结果显示,当乙腈与HEPS缓冲液按照体积比8∶2混合时,体系达到较好的荧光猝灭效果,因此试验选择溶剂为体积比8∶2的乙腈-HEPS缓冲液的混合液。

2.2 PNTU 探针浓度的选择

试验考察了浓度为5,10,15,20,25μmol·L－1的PNTU 探针溶液对Hg2＋-PNTU 体系荧光强度的影响。结果显示,当 PNTU 探针浓度为20μmol·L－1时,体系荧光被较大程度地猝灭。因此,试验选择PNTU 探针的浓度为20 μmol·L－1。

2.3 反应时间的选择

在上述试验条件下,分别在Hg2＋加入后反应1,3,10,30,60,120 min时测定Hg2＋-PNTU 体系的荧光强度,考察了反应时间对体系荧光强度的影响。结果显示,在加入Hg2＋1 min后,体系的荧光强度几乎没有变化,说明Hg2＋与PNTU 探针反应较迅速,反应时间对该体系荧光强度的影响不大。

2.4 PNTU 探针对Hg2＋的专一性

在含20μmol·L－1PNTU 探针的乙腈-HEPS缓冲液的混合液中,分别加入含20μmol·L－1的Mn2＋、K＋、Ni2＋、Al3＋、Na＋、Zn2＋、Cd2＋、Hg2＋、Fe3＋、Cr3＋、Cu2＋、Ag＋、Co2＋、Mg2＋等14种金属离子的乙腈-HEPS缓冲液的混合液,按仪器工作条件测定上述体系的荧光强度,所得体系的荧光强度和溶液颜色变化见图3。

图3 金属离子对体系荧光强度和溶液颜色的影响Fig.3 Effect of metal ions on fluorescence intensity of system and color of the solution

由图3可知:仅Hg2＋存在时,体系荧光强度明显降低,并且溶液颜色由黄色变为橙红色;而加入其他13种金属离子后,体系荧光强度和溶液颜色均未发生明显变化,表明PNTU 探针对Hg2＋的识别具有较高的专一性。

2.5 干扰试验

在含20μmol·L－1PNTU 探针的乙腈-HEPS缓冲液的混合液中分别 加入20 μmol·L－1的Mn2＋、K＋、Ni2＋、Al3＋、Na＋、Zn2＋、Cd2＋、Hg2＋、Fe3＋、Cr3＋、Cu2＋、Ag＋、Co2＋、Mg2＋等14种金属离子溶液。首先观察溶液颜色的变化,发现只有含Hg2＋的溶液颜色由黄色变成橙红色。再将等量的Hg2＋溶液分别加入到上述体系中,此时溶液颜色均变为橙红色,体系荧光强度变化见图4。

图4 金属离子对PNTU 探针识别Hg2＋的影响Fig.4 Effect of metal ions on Hg2＋recognition with PNTU probe

由图4可知,其他离子的存在不干扰PNTU 探针对Hg2＋的比色识别。

2.6 标准曲线和检出限

将Hg2＋标准储备溶液逐级稀释,配制成0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0μmol·L－1的Hg2＋标准溶液,按照试验方法测定各体系的荧光强度,结果见图5。

由图5可知,随着Hg2＋浓度的增大,体系的荧光强度逐渐降低。据此,可建立测定Hg2＋的标准曲线。

图5 Hg2＋浓度对体系荧光强度的影响Fig.5 Effect of concentration of Hg2＋on fluorescence intensity of system

以Hg2＋的浓度为横坐标,其对应体系的荧光强度降低值(ΔF)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,Hg2＋的浓度在20.0μmol·L－1以内与其对应体系的荧光强度降低值呈线性关系,线性回归方程为ΔF＝－2.311×103c＋6.163×103,相关系数为0.998 4。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果为1.8 nmol·L－1。同时,与文献中测定Hg2＋的方法进行对比,结果见表1。

表1 不同Hg2＋检测方法的比较Tab.1 Comparison of different methods for Hg2＋detection

由表1可知,本方法对Hg2＋的测定有较高的灵敏度。

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法对实际水样进行测定,结果显示,水样中均未检出Hg2＋。对水样进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表2可知,Hg2＋的回收率为99.6%～104%,测定值的RSD 为0.85%～2.6%。

2.8 检测试纸的应用

为了拓展PNTU 探针对Hg2＋检测的实际应用性能,设计制作了以PNTU 为探针的比色检测试纸。

将Waterman 3M 滤纸用10%(体积分数)盐酸溶液浸泡,然后用水多次洗涤直至中性,真空烘干,在1×10－3mol·L－1PNTU 探针溶液中浸泡20 s后,于40 ℃恒温真空干燥箱烘干20 min,制得检测试纸。将Hg2＋与废水中其他离子及有机物混合,配制模拟废水溶液,其中 Hg2＋浓度为2×10－3mol·L－1,其他离子浓度为2×10－5mol·L－1。将模拟废水与体积比8∶2的乙腈-HEPS缓冲液的混合液按照体积比1∶4混合,在制备好的试纸上滴加上述含Hg2＋的模拟废水。

结果表明,试纸颜色由黄色变为橙红色,说明该试纸可快速检测模拟废水中是否存在Hg2＋。用含Hg2＋的模拟废水来测试Hg2＋的检出限,当浓度低于15 nmol·L－1时,试纸显色较浅,需借助空白试纸才可以辨认,因此该检测试纸对Hg2＋的检出限为15 nmol·L－1。

本工作设计合成了一种硫脲PNTU 探针,采用荧光猝 灭法考察 了其对Mn2＋、K＋、Ni2＋、Al3＋、Na＋、Zn2＋、Cd2＋、Hg2＋、Fe3＋、Cr3＋、Cu2＋、Ag＋、Co2＋、Mg2＋等14种金属离子的识别性能。结果显示,PNTU 探针能够对Hg2＋进行专一性比色识别,并且干扰试验证明,PNTU 探针在有其他金属离子存在的情况下仍可检测出 Hg2＋,检出限为1.8 nmol·L－1,表明该方法对Hg2＋检测具有较高的灵敏度。此外,基于PNTU 探针对Hg2＋的专一性识别,制备了Hg2＋的检测试纸,可用于方便快捷地检测模拟废水中是否存在Hg2＋,具有一定应用前景。