干扰Hela细胞TPX2基因对细胞活性及其放疗敏感性的影响研究

祁小丽， 王玉婷， 杨 杰

(新疆乌鲁木齐市新疆维吾尔自治区人民医院放疗二科， 新疆 乌鲁木齐 830001)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高。目前，临床上对中晚期宫颈癌主要是放射治疗，治疗早期能够取得较好的疗效，但后期随着放疗剂量的累积，可出现宫颈癌细胞对放疗敏感性降低的现象，影响治疗效果与预后[1]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)与细胞周期进展密切相关，可有效调控细胞周期相关蛋白，在维持有丝分裂稳态的过程中起着重要作用[2]。TPX2在多种恶性肿瘤疾病中存在高表达的现象，该表达与细胞的异质性具有较高的相关性[3]。本研究旨在通过沉默宫颈癌细胞的TPX2基因探讨其对宫颈癌细胞活性及放疗敏感性的影响。

1 资料与方法

1.1细胞、试剂及仪器：宫颈癌细胞(Hela细胞系)购自上海弘顺生物科技有限公司，质粒载体来源于上海柯雷生物科技有限公司，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、cDNA逆转录试剂盒来源于杭州弗德生物科技有限公司，蛋白质印迹法(Western Blot)试剂盒来源于苏州泓迅生物科技有限公司，TPX2的兔抗人抗体、羊抗兔抗体来源于南京霆瑞生物科技有限公司，Transwell小室来源于山东维真生物科技有限公司，CCK-8试剂盒来源于广州鼎国生物技术有限公司，细胞培养箱、培养液来源于美国康宁生物科技有限公司，聚合酶链反应(PCR)仪来源于美国应用生物系统有限公司，流式细胞仪来源于美国艾森生物科技有限公司。

1.2细胞培养、TPX2基因的干扰及分组：将宫颈癌Hela细胞系置于37℃、5% CO2、饱和湿度的环境中，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。稳定传代3代以上，取对数生长期细胞进行研究，依据对载体的处理方式分为干扰组、阴性对照组(NC组)、空白对照组(CON组)，各自采取不同的处理手段。①干扰组：利用电穿孔法进行TPX2基因的定向敲除[4]，将宫颈癌Hela细胞制备细胞悬液，将30～50μg线性化的载体DNA加入悬液，于230V、300μF的环境下定向穿孔敲除TPX2基因，继续培养48h备用。②NC组：对TPX2基因之外的无关序列采用相同的定向敲除方法。③CON组：不采用任何基因敲除方法，载体处理完毕后各自转染宫颈癌Hela细胞。

1.3宫颈癌Hela细胞中TPX2 mRNA和蛋白表达的检测：Hela细胞1×106个去掉培养基后，用PBS洗涤3次后，采用TRIZOL试剂盒提取总RNA，逆转录呈cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测TPX2的相对表达量。TPX2的引物序列：F：5′-ATGGTTTGAGGAGAAGGCCA-3′,R：5′-TATGGCTGCCTCAACTTCCA-3′，扩增产物大小为229bp。人GAPDH作为内参，采用ΔΔCt法计算TPX2 mRNA的相对表达量。采用Western blot法检测TPX2蛋白的表达，兔抗人TPX2多克隆抗体购自武汉博士德公司(A01610-1)，抗人GAPDH一抗和山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司(BA1056)。

1.4宫颈癌Hela细胞增殖能力的检测：将各组细胞以1×105/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，置于细胞培养箱中分别培养0h、24h、48h、72h、96h，培养结束前4h向每孔中加入CCK-8溶液10μL，继续培养4h后于光度计450nm波长处测定吸光值，拟制细胞生长曲线。

1.5宫颈癌Hela细胞迁移能力的检测：将细胞以5×105/mL的密度接种于Transwell上室，每室100μL，下室中加入培养基培养24h。培养结束后移除剩余培养基及未迁移的细胞，固定下室细胞，滴入结晶紫液，记录迁移细胞的数目。

1.6宫颈癌Hela细胞周期占比的检测：各组细胞培养48h后利用胰酶消化，随后离心、洗涤、固定。对细胞进行染色标记，置入流式细胞检测管，结合配套软件测定并分析细胞周期中各期占比，包括G0/G1期、S期及G2/M期等。

1.7宫颈癌Hela细胞放疗敏感性的检测：采用克隆形成实验，L-Q线性平方模型曲线拟合。6孔板按照每孔接种500个细胞，接种12h后，按照梯度剂量0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy给予一次性照射，照射后在细胞培养箱中培养14d，去掉细胞培养基，PBS洗涤3次后，1%的结晶紫染色30min，自来水冲洗干净，拍照，照片采用IMAGE PRO plus计算克隆数。存活率=克隆数/接种细胞数，存活分数=存活率/0剂量存活率，以梯度剂量对应的存活分数模拟曲线S=e^(αd+βd2)，计算α/β值。

2 结 果

2.1TPX2 mRNA及蛋白质的相对表达水平：三组间TPX2 mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。与CON组相比，NC组细胞的TPX2 mRNA相对表达量无明显变化(P>0.05)；与CON组及NC组相比较，干扰组细胞的TPX2 mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)。三组间TPX2 蛋白的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，与CON组相比较，NC组细胞的TPX2蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)；与CON组及NC组相比较，干扰组细胞的TPX2蛋白质的相对表达水平明显降低(P<0.05)(见图1)。

图1 TPX2基因mRNA及其蛋白的表达

2.2TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞增殖能力的影响：随着培养时间的延长，三组细胞的细胞活性均呈升高趋势，但自48h开始干扰组细胞的细胞活性在各个时间点均明显低于NC组(P<0.05)，而NC组与CON组的细胞活性在各时间点无明显改变(P>0.05)(见图2)。

图2 TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞增殖能力的影响

2.3TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞迁移能力的影响：与CON组(35.78±2.19)相比，NC组的迁移细胞数(36.44±1.63)无明显变化。与NC组(36.44±1.63)及CON组比，干扰组细胞的迁移细胞数(22.47±2.19)明显减少(P<0.05)(见图3)。

图3 TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞迁移能力的影响

2.4TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞周期占比的影响：三组的G0/G1期、G2/M期及S期的细胞周期占比组间差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比，干扰组细胞的S及G2/M期细胞占比明显增多，而G0/G1期细胞占比明显减少(P<0.05)。而与CON组相比，NC组的上述指标无明显改变(P>0.05)。(见图4、表1)。

图4 TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞周期占比的影响

表1 TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞周期占比的影响(%)

2.5TPX2基因干扰对于宫颈癌Hela细胞放疗敏感性的影响：CON组和干扰组放疗后克隆形成(见图5)，克隆形成率(见表2)。结果显示，随着放疗剂量的提升，干扰组的生存率逐步低于CON组。与CON组相比，干扰组细胞在放疗剂量为4Gy、6Gy、8Gy、10Gy的生存率降低(P<0.05)。LQ曲线拟合分析(见图6)，干扰组α=0.14，β=0.021，L-Q方程Y=e-(0.14d+0.021*d2)(R2=0.996)，α/β=6.6；CON组α=0.088，β=0.0215，L-Q方程Y=e-(0.088d+0.0215*d2)(R2=0.995)，α/β=4.09。

表2 放疗后克隆形成率情况

图5 CON组和干扰组放疗后克隆形成

图6 LQ曲线拟合分析

3 讨 论

对于中晚期宫颈癌患者，首选同步放化疗，总体疗效较好，但肿瘤细胞对放疗的敏感性可能存在剂量相关性，过高的照射剂量可能会降低肿瘤敏感性而影响疗效[5,6]。TPX2是一种在细胞周期中发挥重要作用的物质，其可能在肺癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中存在高表达现象，且肿瘤的变异程度越高时表达越明显。因此可考虑从抑制TPX2的角度治疗恶性肿瘤，通过干扰抑制TPX2基因的表达，阻碍肿瘤细胞的过度增殖[7]。

干扰宫颈癌Hela细胞TPX2基因可干扰其表达，阻碍其增殖、迁移等细胞活性，有效提高宫颈癌Hela细胞的放疗敏感性。TPX2基因可在宫颈癌的诊治中发挥重要作用[8]：可利用TPX2的表达水平早期筛查宫颈癌，且有效评价宫颈癌的恶性程度。因此可考虑从基因水平抑制TPX2基因的表达，抑制细胞周期中蛋白的生成，阻滞肿瘤的生成与转移，可作为针对性治疗的有效靶点。因此，TPX2基因可作为宫颈癌临床诊治的重要方向之一。

本研究采用电穿孔法干扰TPX2基因的表达，检测结果显示干扰组细胞的TPX2 mRNA及蛋白质表达水平均明显降低，表明对Hela细胞中的TPX2基因已成功进行了干扰，可以进行后续研究。干扰TPX2基因的表达后宫颈癌细胞的增殖能力及迁移能力均受到抑制，这表明TPX2基因在宫颈癌细胞的增殖与迁移过程中有重要的促进作用，临床上可以通过干扰TPX2基因的表达抑制宫颈癌的生长及转移。此外，本研究还发现干扰TPX2基因的表达还能够影响细胞周期，使处于S及G2/M期的宫颈癌细胞占比增多。这可能是由于TPX2蛋白可特异性结合纺锤体，促进动力蛋白吸附于微管结构中，确保纺锤体结构的延续性及功能的完整性[9]，与细胞周期关系密切，抑制TPX2基因的表达可中断细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的增殖[10]。研究表明，高表达TPX2可阻碍放疗生成γ-H2AX，降低放疗对肿瘤细胞的杀伤效果，而肿瘤细胞中TPX2蛋白含量降低时接受放疗γ-H2AX的生成水平会明显提高，γ-H2AX在接受放疗后的存续时间可能与肿瘤细胞的放疗敏感性密切相关[11]。本研究结果显示，干扰TPX2基因的表达后宫颈癌细胞对于放疗的敏感性明显提高，这与以往的研究结果相吻合。

综上所述，TPX2可作为宫颈癌基因诊治的关键靶标。干扰TPX2基因可有效干扰TPX2基因的表达，阻碍宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移等能力。干扰TPX2基因可有效提高宫颈癌Hela细胞的放疗敏感性，增加疗效并改善生存期。因此，从TPX2基因入手可考虑作为宫颈癌临床诊断及救治的重要方向，但本研究纳入的样本量少，基因干扰成功率存在差异限制了研究的推广，对于其他潜在基因靶标的研究较少，仍存在一些不足之处。后续还需进一步作长时程、大样本量研究。