电针调控TXNIP/NLRP3通路介导的焦亡途径对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用研究

邓寒冰， 李春琴， 张 粲， 金祖敏

(1.海南省海口市第三人民医院针灸理疗科， 海南 海口 571100 2.海南医学院第二附属医院针灸科， 海南 海口 571100 3.云南中医药大学推拿基础教研室， 云南 昆明 650500 4.贵州省织金县中医院治未病科， 贵州 毕节 552100)

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)为围生期窒息等引起的脑血流分布不平衡、脑动脉供血减少所致的病理损伤，可造成癫痫、脑瘫等神经功能障碍性后遗症，严重者导致新生儿死亡[1]。HIBD涉及炎症、自噬、氧化应激等机制参与，其中炎症所致神经细胞破坏及死亡为HIBD继发后遗症难以治疗的原因[2]。硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)为硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)的内源性抑制剂，可抑制Trx清除活性氧的抗氧化功能，导致Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性途径的激活，诱导细胞焦亡，是导致神经元凋亡的关键机制之一[3]。NLRP3炎性小体在HIBD大鼠中处于活化状态，可能介导缺氧缺血引起的神经元细胞病变，参与HIBD发生与发展[4]。而抑制TXNIP/NLRP3信号通路，可减轻脑缺血所致神经炎症，改善HIBD新生大鼠细胞炎性焦亡，减轻脑损伤[5]。电针为传统医学针灸的一种形式，被应用于癫痫、脑血管意外后遗症、神经官能症等疾病的治疗，临床及动物研究显示，电针对脑卒中患者和脑缺血缺氧大鼠的神经功能均有明显改善作用[6]，可减轻神经细胞炎症及凋亡等，然而其具体机制不清楚。本研究从TXNIP/NLRP3介导的细胞焦亡途径为切点，探讨电针是否能通过调控TXNIP/NLRP3细胞焦亡通路减轻HIBD所致脑损伤。

1 材料与方法

1.1动物:新生7日龄SD大鼠，SPF级，体重(14±2)g，购自江苏兆生源生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0014，动物使用许可证号：SYXK(苏)2018-0027，动物质量合格证号：C006317。将新生大鼠在动物房中与孕鼠一起适应饲养一周，本实验经医院实验动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂及仪器:TXNIP阴性对照CRISPR质粒(TXNIP NC CRISPR质粒)、TXNIP过表达CRISPR质粒(TXNIP OE CRISPR质粒)(购自上海吉玛基因公司，批号C03019、C05113)；红四氮唑(TTC)试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、尼氏(Nissl)染色试剂盒、TUNEL检测试剂盒、大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)酶联免疫吸附试剂盒(购自上海碧云天公司，批号：AF813、P7219-2、C0812、C1092D、SF20117、SF60113)；DAPI试剂盒、蛋白提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，批号：BC4027、BC6028)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved-caspase-1)、天冬氨酸蛋白水解酶-1前体(pro-caspase-1)、TXNIP、凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)、NLRP3、β-actin单克隆抗体、羊抗鼠二抗(购自美国Santa cruz公司，批号：SC-1009、SC-1063、SC-2035、SC-50117、SC-50223、SC-00019、SC-00013)；电子针灸仪(四川恒明医疗器械有限公司，型号：HM6805-I)；光学显微镜(日本尼康公司，型号：E200)；荧光显微镜(北京上光仪器有限公司，型号：XSP-SG-63XF)；电泳仪(济南童鑫生物科技有限公司，型号：DYCP-31DN)；凝胶成像仪(北京大龙兴创实验仪器股份公司，型号：GelSMART)；酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMax iD3)。

1.3实验方法

1.3.1模型制备、分组及处理:将75只新生大鼠随机抽取15只作为假手术(Sham)组，其余60只新生大鼠采用改良RICE法复制HIBD大鼠模型[7]，即双重结扎左颈总动脉并在结扎处之间切断血管，认真缝合皮肤后保温恢复1h，而后置于含8%氧气和92%氮气的透明盒中缺氧2.5h。HIBD大鼠模型制备成功后采用随机数字表法分为HIBD组(仅造模，不进行其他处理)、电针组：造模后，根据《靳三针问答图解》《实验针灸学》并结合人与大鼠骨密度类比定位穴位，选取脑三针、智三针、颞三针穴位，针刺后连接电针仪行电针治疗，1次/d，每次20min，共治疗2周，并于每周第1天2%异氟烷吸入麻醉大鼠，借助脑立体定位仪和显微注射器，在电针治疗前6h经脑室注射2L注射无菌生理盐水，共2次)、电针+TXNIP NC组[电针治疗方法同电针组，在电针治疗期间，于每周第1天麻醉大鼠后，借助脑立体定位仪和显微注射器，经脑室注射2 L TXNIP NC CRISPR质粒(1 nmoL/L)，共注射2次]和电针+TXNIP OE组[电针治疗方法同电针组，在电针治疗期间，于每周第1天麻醉大鼠后，借助脑立体定位仪和显微注射器，经脑室注射2 L TXNIP OE CRISPR质粒(1 nmoL/L)，共注射2次]，每组15只。Sham组仅暴露左颈总动脉，不结扎和缺氧，造模结束后不进行电针干预和脑室注射。

1.3.2莫里斯水迷宫测试:电针治疗后，每组随机取5只大鼠，根据文献采用莫里斯水迷宫测试大鼠学习记忆能力[8]，共对大鼠进行7d的测试。每次试验时，将大鼠在四个象限中释放点之一放入水中，让其自主寻找平台。视频记录测试过程中大鼠所有活动，并通过视频跟踪系统分析其游泳路径，记录其逃避潜伏期。第7天将平台撤掉，记录其穿越平台的次数。所有试验最多持续60s，若超出60s则将大鼠手动引导至平台。

1.3.3样本采集及TTC染色:末次电针治疗12h后，各组大鼠均腹腔注射100mg/kg戊巴比妥钠麻醉处死。随机取5只，经心脏灌注4℃预冷的磷酸缓冲液，断头取脑，借助切片模具自额极将大脑进行冠状切片(2mm/片)，所有切片均浸没在2% TTC溶液中，室温避光孵育20min，转至4%多聚甲醛溶液中固定，排列整齐拍照，采用ImageJ软件分析，计算脑梗死体积，脑梗死体积=(5张切片白色梗死面积之和/5张切片总脑面积之和)×100%。其余5只断头取脑、摘离出梗死侧海马组织，每只取约2cm3组织块、切碎后于液氮速冻，-80℃保存待测。剩余海马组织用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定后，制备石蜡切片(10m/片)。

1.3.4HE染色及Nissl染色:将1.3.4中部分切片分别采用HE试剂盒和Nissl试剂盒染色，封片后观察。在光学显微镜下观察海马神经细胞形态。每组至少观察6张切片。

1.3.5免疫荧光检测:对1.3.4中石蜡切片按顺序进行脱蜡、柠檬酸盐缓冲液抗原修复、含0.1% Triton X-100 PBS溶液通透、2%山羊血清封闭、滴加TUNEL试剂盒工作液后，加入cleaved-caspase-1一抗(1∶200)4℃孵育过夜，加入羊抗鼠二抗(1∶500)室温避光孵育45 min，加入DAPI试剂避光孵育6 min，加入封闭液并封片。放在荧光显微镜下观察细胞焦亡率，细胞焦亡率(%)=(cleaved-caspase-1+TUNEL+DAPI+细胞数量/DAPI+细胞数量)×100%，每组至少10张切片，每个切片观察5个视野计算平均值。

1.3.6蛋白免疫印迹检测:研钵粉碎海马样品后采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白质，BCA法测定浓度，各组取30g煮沸变性，依次进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜，奶粉封闭。加入一抗cleaved-caspase-1(1∶1000)、pro-caspase-1(1∶2000)、TXNIP(1∶1000)、ASC(1∶2000)、NLRP3(1∶2000)和β-actin(1∶2500)一抗4℃过夜孵育。第2天用1×Tris缓冲液洗膜3次，将膜放入相应二抗(1∶5000)中，室温孵育1.5h，再次洗膜3次后，加入发光液显影，TANON成像系统采集图像，并采用自带软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.3.7ELISA检测:取1.3.5中海马冷冻样品，按照ELISA试剂盒说明书进行处理，依次加入工作液、终止液，于酶标仪450nm处检测各孔吸光值，根据事先制作的标准曲线，计算各大鼠海马中IL-1β、IL-18水平。

2 结 果

2.1各组大鼠脑梗死体积比较:与Sham组比较，HIBD组脑梗死体积明显增大(P<0.05)；与HIBD组比较，电针组、电针+TXNIP NC组脑梗死体积减小(P<0.05)；与电针组、电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组脑梗死体积增大(P<0.05)。见图1、表1。

表1 各组大鼠脑梗死体积学习记忆能力及细胞焦亡的比较

图1 各组大鼠脑梗死体积比较(TTC染色)

2.2各组大鼠学习记忆能力比较:与Sham组比较，HIBD组大鼠穿越平台的次数明显减少，逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与HIBD组比较，电针组、电针+TXNIP NC组大鼠穿越平台的次数增多，逃避潜伏期缩短(P<0.05)；与电针组、电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组穿越平台的次数减少，逃避潜伏期延长(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠海马区病理损伤观察:Sham组海马区神经细胞排列规则致密，胞核染色均匀，胞质边界清晰，形态正常；HIBD组神经细胞排列错乱疏松，胞核皱缩深染，胞质边界模糊，尼氏小体数量减少；与HIBD组比较，电针组和电针+TXNIP NC组海马区细胞损伤均明显改善，尼氏小体数量增多；与电针组和电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组海马区细胞损伤加重，尼氏小体数量减少。见图2。

图2 各组大鼠海马组织Nissl染色和HE染色情况(×200)

2.4各组大鼠海马区细胞焦亡比较:与Sham组比较，HIBD组海马区cleaved-caspase-1+TUNEL+细胞明显增多(P<0.05)；与HIBD组比较，电针组、电针+TXNIP NC组海马区cleaved-caspase-1+TUNEL+细胞减少(P<0.05)；与电针组、电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组cleaved-caspase-1+TUNEL+细胞增多(P<0.05)。见图3、表1。

图3 各组大鼠海马区细胞焦亡情况(×200)

2.5各组大鼠海马组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达水平比较:与Sham组比较，HIBD组大鼠海马组织cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)；与HIBD组比较，电针组、电针+TXNIP NC组大鼠海马组织cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平降低(P<0.05)；与电针组、电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组大鼠海马组织cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平升高(P<0.05)。见图4、表2。

表2 各组大鼠海马组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达水平比较

图4 各组大鼠海马组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白情况

2.6各组大鼠海马组织IL-18 IL-1β水平比较:与Sham组比较，HIBD组大鼠海马组织IL-18、IL-1β水平明显升高(P<0.05)；与HIBD组比较，电针组、电针+TXNIP NC组大鼠海马组织IL-18、IL-1β水平减少(P<0.05)；与电针组、电针+TXNIP NC组比较，电针+TXNIP OE组大鼠海马组织IL-18、IL-1β水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠海马组织IL-18 IL-1β水平比较

3 讨 论

虽然围产期监测及医疗技术取得了重大进步，HIBD仍是导致新生儿死亡和永久性神经系统残疾的主要原因之一，并且没有药物或治疗方式能够持续改善围产期HIE后婴儿的长期存活率[9]，因此，寻找新疗法成为必要。本研究通过采用改良RICE法复制HIBD大鼠模型，并分析电针对HIBD大鼠模型的作用机制，为HIBD的治疗提供参考。海马为负责学习记忆的主要功能区，外部信号传递到神经中枢后在此进行整合，发生损伤可引起学习记忆能力下降，而脑缺血缺氧极易造成海马区神经细胞炎症和焦亡。另有研究发现，HIBD患儿的海马区椎体细胞的生理特性和突触传递功能受到破坏，呈现病理损伤[10]。本研究显示，与Sham组比较，HIBD组大鼠脑梗死体积增加，穿越平台的次数减少，逃避潜伏期延长，神经细胞排列错乱疏松，胞质边界模糊，数量减少，显示缺血缺氧可造成新生大鼠脑梗死，导致神经功能和学习记忆能力弱化。已证实，海马区神经细胞炎症和焦亡与缺血缺氧导致的脑损伤密切相关[11]，本研究亦发现，与Sham组比较，HIBD组海马区cleaved-caspase-1+TUNEL+细胞显著增多，提示缺血缺氧造成新生大鼠海马区神经细胞炎症及焦亡，与其脑损伤及学习记忆能力弱化有关。针刺主要通过对人体经络穴位进行刺激，通过调气血、通经络等实现改善脏器功能、治疗疾病的目的，具有操作简单、安全经济等特点。传统针刺疗法“靳三针”中的脑三针、智三针、颞三针在治疗幼儿脑病方面已取得较为肯定的疗效。动物实验亦证明，“靳三针”针刺疗法可促进海马神经元自噬，阻止小胶质细胞活化及炎性坏死，保护神经功能，改善HIBD新生大鼠学习记忆和自主活动能力[12]。电针为针刺的创新与改进，主要在毫针针刺的基础加以电流刺激，已有研究表明，电针可能为促进脑瘫功能恢复的另一种治疗选择[13]。本研究对HIBD新生大鼠的脑三针、智三针、颞三针选穴进行电针刺激，结果显示，电针治疗后，脑梗死体积及逃避潜伏期显著降低，穿越平台的次数增多，海马区神经细胞损伤减轻，伴随cleaved-caspase-1+TUNEL+细胞减少，表明电针治疗可明显抑制海马细胞焦亡，减轻脑损伤，提高学习记忆能力。但其作用机制并不清楚。近年研究发现，依赖于炎症的细胞焦亡为细胞死亡的另一种典型程序，TXNIP∕NLRP3通路通过介导细胞焦亡参与多种缺血缺氧所致器官损伤的发生和发展[14]。正常状态下，TXNIP与还原型Trx结合，维持其抗氧化能力；缺血缺氧状态下，机体内氧化应激水平较高，Trx被氧化后TXNIP与之解离，转而与NLRP3结合并诱导NLRP3炎性小体活化，随之将pro-caspase-1剪切为具有活性的cleaved-caspase-1，介导细胞肿胀破碎，同时诱导IL-1β、IL-18等炎性因子产生，引起炎症反应，诱导细胞焦亡[15]。脑缺血再灌注所致神经细胞损伤与NLRP3介导的细胞焦亡密切相关[10]。抑制TXNIP/NLRP3炎性体激活，可使缺血引起的脑梗死和水肿程度降低，组织病理学及神经功能损伤改善。本研究发现，相较于Sham组，HIBD组新生大鼠海马中cleaved/pro-caspase-1、ASC、NLRP3、TXNIP蛋白及IL-18、IL-1β水平均增加，表明HIBD新生大鼠脑组织中TXNIP/NLRP3焦亡通路被活化。而电针治疗后，海马中cleaved/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白及IL-18、IL-1β水平均显著低于HIBD组，推测电针可降低TXNIP表达，进而抑制NLRP3介导的细胞炎症及焦亡。为验证该猜想，本研究采用TXNIP CRISPR激活质粒和电针联合干预HIBD新生大鼠，结果显示TXNIP OE CRISPR质粒可逆转电针对NLRP3焦亡通路的抑制作用及对海马神经细胞损伤的改善作用，进一步证明电针可能通过抑制TXNIP/NLRP3通路，减轻焦亡，改善神经细胞和脑损伤。综上，本研究认为电针可能通过抑制TXNIP/NLRP3通路介导的细胞焦亡，减轻神经细胞损伤，改善HIBD大鼠学习记忆能力，然而HIBD涉及的病理过程较为复杂，电针改善HIBD神经损伤的作用可能涉及其他机制，有待进一步探究。