EGFR和KRAS在肺腺癌和肺鳞癌中的突变差异和临床意义

常莹，曹阳，孔薇薇

(联勤保障部队第967医院肿瘤科，辽宁 大连 116000)

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占85%以上，早期NSCLC隐匿性高，多数患者明确诊断时癌症已进展至中晚期[1]。表皮生长因子受体(EGFR)突变基因作为NSCLC中最常见的驱动基因，相关酪氨酸激酶抑制剂的问世及临床应用，引领肺癌的治疗手段从手术、化疗、放疗走向了分子靶向治疗的新阶段[2-3]。随着基因检测技术以及肿瘤相关分子信号转导通路的发展，肺癌相关驱动基因被相继发现，NSCLC的分子基因谱不断更新，除EGFR外，还包括鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)等。KRAS是EGFR信号通路的下游调控基因，KRAS突变是导致患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药的重要原因之一[4]。因此，EGFR和KRAS基因突变状态的鉴别对NSCLC的分子靶向治疗至关重要，但临床实践中往往因无法获取足够的检测标本，进而导致EGFR和KRAS基因突变情况的检测受阻。本研究拟探讨NSCLC患者EGFR和KRAS基因突变状态与临床病理特征的相关性，以期为无法进行EGFR、KRAS突变检测的患者应用EGFR-TKIs提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年6月至2018年6月联勤保障部队第967医院行肺癌根治性手术的120例NSCLC患者为研究对象。纳入标准：(1)均经组织病理学明确为NSCLC；(2)年龄≥18岁；(3)本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。排除标准：(1)合并心、肝、肾、脑等功能障碍者；(2)有其他恶性肿瘤合并史者；(3)临床资料不完整者。所有病例年龄32～81岁，平均(55.84±8.77)岁；男性74例，女性46例；有吸烟史39例，无吸烟史81例；临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期43例，Ⅲ期38例。

1.2 研究方法

使用核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分离试剂盒(厦门艾德生物医药有限公司，货号ADx-FF04)提取RNA，操作严格按照试剂盒说明书进行，将石蜡切片样本(≥5片)放入1.5 mL离心管内，依次使用二甲苯脱蜡、蛋白酶消化后提取总核酸，然后分离纯化RNA；将石蜡切片中提取的RNA以逆转录试剂盒(TAKARA，货号RR037A)逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)后，采用特异性引物经荧光聚合酶链式反应(PCR)仪(Stratagene MX 3000P)检测EGFR和KRAS基因突变，人EGFR基因突变检测试剂盒(货号ADx-E03)和人KRAS基因突变检测试剂盒(货号ADx-KR01)均购自厦门艾德生物医药有限公司；引物设计参考文献[4]，见表1；反应体系20 μL：模板2.7 μL，Taq酶0.3 μL，反应混合液17.0 μL；扩增参数：95 ℃ 5 min进行一个循环；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s进行15个循环；93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s进行31个循环；收集荧光信号，根据说明书判读原则进行结果判定，即当样品Ct值小于阴性临界值时为阳性。所有患者术后定期门诊随访观察两年，记录患者随访期内复发、转移和死亡情况。主要观察终点为无病生存期(disease free survival，DFS)，指术后第1天至患者出现复发、进展或死亡的时间。

表1 EGFR外显子19～21及KRAS外显子2引物序列

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料采用[n(%)]表示，组间比较采取χ2检验或Fisher精确检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，并使用Log-rank法进行显著性检验。所有检验资料均采取双侧检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者EGFR和KRAS基因突变情况

120例NSCLC患者中，45例(37.50%)检出EGFR基因突变，11例(9.17%)检出KRAS基因突变。45例EGFR基因突变中，以21外显子L858R突变和19外显子Del突变为主，分别占48.89%(22/45)、40.00%(18/45)；其余包括20外显子INS、21外显子L861Q突变，分别占4.44%(2/45)、2.22%(1/45)，及2例联合突变，分别是19外显子Del联合20外显子T790M突变1例，19外显子Del联合21外显子L858R突变1例。11例KRAS基因突变中，均为外显子2突变，包括Gly12Cys突变5例，Gly12Asp突变3例，Gly12Ala突变1例，Gly12Ser突变1例，Gly12Val联合Gly12Arg突变1例。

2.2 EGFR和KRAS基因突变与NSCLC患者临床病理特征的关系

EGFR基因突变率在不同年龄、临床分期、分化程度患者比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，女性患者EGFR突变率高于男性患者(P<0.05)，腺癌患者EGFR基因突变率高于鳞癌患者(P<0.05)，无吸烟史的患者EGFR突变率高于有吸烟史者(P<0.05)。KRAS基因突变在不同年龄、临床分期、分化程度患者比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，男性患者KRAS突变率高于女性患者(P<0.05)，腺癌患者KRAS基因突变率高于鳞癌患者(P<0.05)，有吸烟史的患者KRAS突变率高于无吸烟史者(P<0.05)。见表2。

表2 EGFR和KRAS基因突变与NSCLC患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 EGFR和KRAS基因突变与NSCLC患者预后的关系

对EGFR、KRAS基因突变型和野生型患者生存资料使用Kaplan-Meier生存分析。结果显示，EGFR突变型和EGFR野生型的患者术后2年无病生存率(71.11%vs.57.33%)比较，差异无统计学意义(Log-rankχ2=2.381，P>0.05)。KRAS突变型和KRAS野生型的患者术后2年无病生存率(45.46%vs.64.22%)比较，差异无统计学意义(Log-rankχ2=2.608，P>0.05)。见图1。

3 讨论

得益于针对EGFR突变的靶向药物，晚期NSCLC的分子靶向治疗取得了重大突破。KRAS驱动基因突变能引起EGFR信号通路持续激活而加速肿瘤细胞增殖[5]。KRAS基因突变与NSCLC对吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI类靶向药物的耐药性密切相关。2019版美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)非小细胞肺癌指南指南[6]指出，EGFR、KRAS基因突变是EGFR-TKIs疗效的预测指标，临床上患者使用EGFR-TKI类靶向药物前须进行相关基因突变的检测。而对于部分不能进行EGFR、KRAS突变检测的患者，总结与EGFR、KRAS突变相关因素，将有助于为临床应用EGFR-TKIs提供参考依据，从而最大限度地使患者获益。

本研究显示，EGFR基因突变率为37.50%，且突变类型以21外显子L858R突变和19外显子Del突变为主；而张玉萍等[7]报道国内山东潍坊地区EGFR基因突变率约为42.24%，略高于本研究，且突变以19和21外显子为主，比例高达87.85%；杨长绍等研究[8]表明，云南宣威地区EGFR基因突变以20和21外显子为主，占51.40%。由此可见，EGFR基因突变率和突变类型具有较明显的地域性。另外，本研究还发现女性、腺癌及无吸烟史的患者EGFR基因突变率更高，与既往报道[9-10]相符。KRAS基因突变状态可以为EGFR-TKIs药物适用人群提供重要参考[11]。KRAS常见突变主要包括外显子2的12和13密码子、外显子3的61密码子[12]。本研究中，KRAS基因突变率为9.17%，均为外显子2第12位密码子的突变，由于KRAS基因突变率较低，本例中受限于样本数量，仅发现部分常见的突变类型，且KRAS基因突变率多发于男性、腺癌及有吸烟史的患者，而与患者年龄、临床分期、分化程度无明显相关性。综合分析患者的临床特征发现，EGFR和KRAS基因突变均好发于腺癌患者，而在鳞癌患者出现较少，两者的发生在临床特征上存在着一定的互斥性，其中EGFR突变多发于女性、无吸烟史人群，而KRAS基因突变好发于男性、有吸烟史的人群，且尚无患者同时检测出EGFR和KRAS基因突变，与既往研究[13]结果相符。

本研究对EGFR突变型与野生型患者生存资料进行Kaplan-Meier生存分析，发现突变状态无法显著影响患者预后生存。然而，针对EGFR等驱动基因的靶向药物可改善突变人群的预后；但KRAS基因突变可导致患者对EGFR-TKIs耐药，进而导致患者预后更差。而本研究中EGFR、KRAS突变状态与预后无关的原因可能在于获得的阳性样本量较小，故在生存分析时可能由于统计效能偏低，存在假阴性结果的可能，后续研究可考虑扩大研究人群、增加样本量，以提高分析结果的准确性。

综上所述，NSCLC患者的EGFR和KRAS基因突变均好发于腺癌患者，而在鳞癌患者出现较少，其中，EGFR突变好发于女性、无吸烟史人群，而KRAS基因突变好发于男性、有吸烟史的人群。