四种乳酸菌对马拉硫磷的手性选择性降解研究

石凯威, 郑尊涛, 赵婷婷, 朱宇珂, 马 成, 李 莉*,

(1. 中国科学院 动物研究所 农业虫害鼠害综合治理国家重点实验室，北京 100101；2. 农业农村部农药检定所，北京 100125)

乳酸菌是可以发酵碳水化合物并产生大量乳酸的一类细菌的统称，在自然界和食品中广泛存在[1]，已广泛应用于乳制品、肉制品、蔬菜制品和软饮料等食品加工业中[2]。目前已经发现的乳酸菌有43个属，包括373个种和亚种，按照形态可分为乳酸杆菌族和链球菌族[3-4]。

研究证明，乳酸菌及其发酵产物对部分有机磷农药有较强的降解作用。王晶等[5-6]发现，保加利亚乳杆菌Lactobacillus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei3株乳酸菌对脱脂乳培养基上的7种有机磷农药残留有一定的降解作用；薄力影等[7]研究表明，选择的7种有机磷农药42 ℃条件下在牛奶样品中的半衰期为11.0～16.7 h，而在两个乳酸菌发酵的酸奶样品中半衰期分别减少至9.6～14.6 h和10.0～15.9 h。目前，有关乳酸菌对手性农药的选择性降解报道较少，陆跃乐[8]研究发现，在有乳酸菌参与的酱油和泡菜加工过程中，S-禾草灵的降解快于其对映体，说明发酵过程中产生了选择性降解。

马拉硫磷是一种常用的有机磷农药，有1个手性中心，2个对映异构体 (图式1)。对马拉硫磷对映异构体的拆分研究已经较为成熟，王鹏等[9-10]考察了流动相中改性剂种类、改性剂含量以及温度对拆分效果的影响。结果表明，异丙醇、丁醇和异丁醇都适合作为改性剂，较低的醇含量和低温都有利于分离效果的提高。马拉硫磷异构体杀虫活性和选择性降解行为研究表明，R-对映体的杀虫活性高于S-对映体，且将马拉硫磷乳油在大白菜、葡萄、甜菜、水稻以及小麦上喷施后表现出不同的选择性行为[11]；马拉硫磷在黄土和红土中的降解半衰期分别为3.5 h和4.3 h，左旋对映体降解较快[12]。马拉硫磷对映体的神经毒性差异研究结果表明，R-对映体对神经细胞生长的抑制效应高于其外消旋体和S-对映体[13-14]；可见，对于马拉硫磷的风险评估仅依靠外消旋体的数据是远远不够的。

本研究采用培养基模拟方法，针对保加利亚杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌4种酸奶发酵中常用的乳酸菌种，对马拉硫磷的手性选择性降解进行了研究，能为推测酸奶酿制和储存过程中手性农药对映体选择性降解，开展手性农药在乳产品等食品中的风险评估，以及对人体的健康安全性评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及药剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA)，配有紫外检测器；Agilent 35900E型数模转换器和IBZ旋光检测器(IBZ Messtechnik GMBH公司)。

马拉硫磷 (malathion) 标准品 (纯度99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，异丙醇和正己烷均为色谱纯(Mallinckrodt Baker)。浓盐酸、氢氧化钠、乙腈、丙酮、石油醚和氯化钠均为分析纯 (国药集团化学试剂有限公司)。弗罗里硅土固相萃取净化柱和氨基固相萃取净化柱 (1 g/6 mL，安谱实验科技股份有限公司)。淋洗液为V(丙酮) :V(石油醚) = 1 : 9。

保加利亚杆菌Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum和干酪乳杆菌Lactobacillus casei冻干菌粉 (中国普通微生物菌种保藏管理中心)。MRS培养基成分(分析纯)：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL。MRS培养基经过灭菌锅121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后待用。

1.2 立体选择性降解试验

1.2.1 含马拉硫磷的 MRS 液体培养基的制备 在超净工作台中，将50 mg/kg马拉硫磷外消旋体标准溶液添加至灭菌后的MRS液体培养基中，摇匀。取10 mL分装至50 mL离心管中。

1.2.2 菌株传代培养 在超净工作台中，将在 −80 ℃冰箱中保存的乳酸菌甘油母液取出，在室温条件下自然解冻，用移液枪 (配有灭菌后的枪头) 以体积分数0.5%的接菌量接种在灭菌后的MRS液体培养基中，置于37 ℃摇床中恒温培养，48 h后以0.5%的接菌量转接于新的MRS液体培养基中。为确保菌株的稳定，传代选在稳定期，以48 h为一个传代周期。为保证乳酸菌的活性，使用第4代菌进行试验。

1.2.3 接种和取样 在超净工作台中，用移液枪(配有灭菌后的枪头) 将活化后的第4代菌接种于含马拉硫磷的MRS液体培养基中，接菌量分别为体积分数0 (对照)、0.5%和5.0%。接种后置于37 ℃摇床中恒温培养，分别于0、2、4、8、20、32、48、96、168和288 h取样测定马拉硫磷对映体的含量，同时测定菌液的OD600值和pH值。每个处理重复3次。

乳酸菌的生长情况通过OD600值进行监测：取200 μL菌液至比色皿中，用蒸馏水稀释至2 mL，用紫外分光光度计测定OD600值。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理 在10 mL MRS培养基中准确加入20 mL乙腈，振荡1 min，加入6 g氯化钠，混匀1 min，于3 000 r/min下离心5 min；取10 mL上清液至茄型瓶中，于35 ℃下旋转蒸发至近干；用5 mL淋洗液预淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液；用5 mL淋洗液洗涤茄型瓶中残渣并转移至固相萃取柱中，再用10 mL淋洗液分两次洗脱；收集全部洗脱液，于35 ℃下旋转蒸发至近干，用正己烷定容至2.5 mL，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3.2 色谱检测条件 Agilent 1200 高效液相色谱仪；CHIRALCEL OD-H (4.6 mm × 250 mm,5 μm) 手性柱；进样量20 μL；流动相为V(正己烷) :V(异丙醇) = 98 : 2；流速1 mL/min；柱温箱温度为室温；检测波长230 nm。

1.4 数据处理

1.4.1 分离度 按公式 (1) 计算分离度 (R)。

式中，t1和t2分别代表峰1和峰2的保留时间；W1和W2分别代表峰1 和峰2在峰底的峰宽。当R≤1时表示两峰有部分重叠；当1

1.4.2 一级动力学方程 按公式 (2) 和 (3) 采用指数回归方程求降解半衰期（t1/2）。

式中，ct代表t时间的农药残留量；c0代表初始浓度；k代表降解速率常数 。

1.4.3 马拉硫磷对映体选择性降解测定 采用对映体分数 (EF值) 作为马拉硫磷对映体选择变化的指标，按公式 (4) 计算。

式中，A1代表先流出的对映体残留量；A2代表后流出的对映体残留量。EF值的范围在0～1之间，当EF = 0.5时表示两个对映体降解速率相同，没有对映体选择性。当EF<0.5和EF>0.5时均表明马拉硫磷产生了立体选择性降解，偏离的值越大，选择性越明显[15]。

2 结果与讨论

2.1 对映体拆分方法的确定

试验测试了使用手性色谱柱CHIRALCEL OD-H在不同流动相 (V(正己烷) :V(异丙醇)=90 :10、94 : 6和98 : 2) 以及不同定容溶剂 (异丙醇或正己烷) 下马拉硫磷两个对映异构体的拆分情况。结果 (表1) 显示，在3种流动相比例条件下，只有当V(正己烷) :V(异丙醇) = 98 : 2时实现了两峰的基线分离，且正己烷定容的分离度大于异丙醇，因此，最终选择V(正己烷) :V(异丙醇) =98 : 2作为流动相，定容溶剂选择正己烷。

表1 马拉硫磷在不同条件下的拆分Table 1 The chromatographic separation of malathion under different conditions

2.2 对映体旋光性分析

在1.3.2节检测条件下，先流出对映体的旋光度为右旋 (+)，后流出对映体的旋光度为左旋 (−)，其紫外和旋光图如图1所示。本研究拆分条件与Sun[11]的基本一致，可以确定先流出的异构体构型为R-(+)-马拉硫磷，后流出的为S-(−)-马拉硫磷。

2.3 分析方法确证

按1.3节的方法进行1、50和150 mg/kg 3个水平的添加回收试验。结果显示：马拉硫磷R-对映体的平均回收率在84%～90%之间，RSD在1.5%～19%之间；S-对映体的平均回收率在81%～90%之间，RSD在2.0%～11%之间。在0.5～500 mg/L范围内，马拉硫磷的峰面积与其质量浓度间呈良好线性关系，R-对映体的线性方程为y= 3.860 6x+2.490 5，R2= 0.999 9；S-对映体的线性方程为y=3.865 1x+ 1.769 0，R2= 1.000 0。所建方法可以准确对MRS培养基中的马拉硫磷进行定量。

2.4 乳酸菌增殖情况及pH值变化

结果 (图2) 表明，4种乳酸菌在0～24 h内的生长速度最快，于36 h时达到最大值，之后逐渐保持稳定；稳定后，干酪乳杆菌0.5%接菌量的处理，其菌液浓度略高于5.0%接菌量的处理，其他3种乳酸菌5.0%接菌量的处理，其菌液浓度略高于0.5%接菌量接菌量的处理。表明乳酸菌的对数生长阶段是在前48 h。此后，乳酸菌菌量保持稳定，进入稳定生长阶段。

本研究同时对培养基pH值进行了测定。结果表明，4种乳酸菌在0～24 h内pH值从7降到5，之后维持在5不变；对照组 (接菌量0%) 的pH值稳定在7。

2.5 马拉硫磷对映异构体的选择性降解

马拉硫磷对映异构体的降解符合一级反应动力学方程。由 (表2) 数据可以看出：随培养时间延长两个对映异构体呈稳定降解趋势。对照组中，R-马拉硫磷的半衰期在4.0～6.0 d之间，S-马拉硫磷的半衰期在3.9～5.6 d之间；处理组中，R-马拉硫磷的半衰期在5.4～6.5 d之间，S-马拉硫磷的半衰期在5.1～6.3 d之间。处理组和对照组间半衰期无明显差异，表明乳酸菌对马拉硫磷降解没有明显影响。

表2 马拉硫磷对映体的降解方程、相关系数和半衰期 (n = 3)Table 2 The degradation equation, correlation coefficient (r), and halflives of malathion enantiomers in culture medium (n = 3)

4种乳酸菌不同接菌量的EF值变化曲线如图3所示。在开始取点时 (0 h) 对照组和乳酸菌处理组的EF值均接近0.50。经过12 d培养后，两个对映异构体的EF值均保持在0.50左右，R-对映体和S-对映体半衰期的比值在0.98～1.07之间。处理组中乳酸菌种类、接菌量等因素对两个对映体的降解无明显影响，表明4种乳酸菌对马拉硫磷没有立体选择性降解作用。与前人研究结果[6]相比，本文侧重点在于对农药异构体选择性降解的分析，且对不同乳酸菌菌株和接菌量的影响分别进行研究。

3 结论

建立并优化了MRS培养基中马拉硫磷两个对映异构体提取和高效液相色谱分析方法，经方法的有效性检验证明，本方法准确度、精密度和线性范围均满足检测要求。通过向MRS培养基中添加马拉硫磷外消旋体的方式，将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚杆菌和嗜热链球菌4种乳酸菌以不同接菌量接种，通过不同培养时间采样测定乳酸菌的活性和pH值变化情况，以及对马拉硫磷对映体降解的影响。结果表明，在本试验条件下，4种乳酸菌均不会加速马拉硫磷的降解，并且不同菌种、接菌量和乳酸菌活性等因素均不会对马拉硫磷产生立体选择性降解。马拉硫磷两个对映体在乳酸菌处理组和对照组中的降解速率相近，不产生立体选择性降解。该研究结果为乳酸菌发酵制品中手性农药残留膳食摄入风险评估的完善提供了数据支持，可为未来开展相关领域的研究提供方法学借鉴和参考。